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Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre.

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1 Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre 2010 L.Mauvieux

2 Concept de la cellule souche Cellule à longue durée de vie Capable dauto-renouvellement (duplication sans perte des capacités de développement) Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires (différenciation) Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes Capables de Prolifération De régénérer des tissus après blessure De plasticité dans ces différentes options

3 Hierarchie des cellules souches

4 Epiderme

5 Jargon des cellules souches Potence définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires Pluripotent pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules spécialisées, mais pas toutes les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes

6 Cellules souches embryonnaires: –1) Cellules ES Dérivées du blastocyste en culture Par transfert nucléaire dune cellule somatique dans un œuf énucléé –2) Cellules somatiques « reprogrammées » « induced pluripotent stem cells » (iPS) –TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4 –Sox2 et Hox4

7 Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines J0 J1 J2 J3 J4 J5 compaction blastocyste

8 Feeder de fibroblastes murins Colonie de cellules ES

9 Critères pour caractériser le caractère de cellule souche (« stemness ») Auto-renouvellement: –Potentiel de renouvellement illimité in vitro –Expression de facteurs de transcription caractérisant la cellule souche (nanoG, oct4, SOX2, TERT…) Pluripotence in vitro: –Formation de tératomes dans la souris imunocompétente (potentiel tumoral) –Pluripotence in vitro

10 Formation de Tératome Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois feuillets embryonnaires –Ectoderme (peau, poils, dents…) –Mésoderme (os, cartilage, muscle…) –Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)

11 Pluripotence des cellules ES in vitro

12 Cellules souches embryonnaires: –1) Cellules ES Dérivées du blastocyste en culture Par transfert nucléaire dune cellule somatique dans un œuf énucléé –2) Cellules somatiques « reprogrammées » « induced pluripotent stem cells » (iPS) –TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4 –Sox2 et Hox4

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20 Chez lhomme

21 Cellules souches « adultes »

22 Tissus à renouvellement rapide=cellules souches cheveux Épithélium digestif Moelle osseuse

23 Cellules souches adultes Les cellules souches adultes sont cruciales pour le renouvellement tissulaire Ces cellules sont capables dauto-renouvellement et de différenciation Lhoméostasie dun organisme adulte résulte de léquilibre entre: – létat quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) –et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le renouvellement tissulaire) Modèle des cellules souches hématopoïétiques (CSH)

24 Modèle CSH Durent toute la vie… Hématopoïèse À la base des greffes de moelle allogéniques: thérapie cellulaire de loin la plus utilisée

25 Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961 Irradiation sub-léthale 1000Gy + Greffe de moelle (IV) CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES TRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE J10: colonies de cellules hématopoïétiques clonales, multi-linéales, dans la rate (CFU-S)

26 CARACTERISATION DES CSH : reconstitution de lhématopoïèse à long terme

27 Suda et coll, Trends in immunology Vol.26 August 2005 Traitement par le 5-fluoro-uracile Anti-métabolite incorporé dans lADN et lARN

28 Tri des cellules par cytomètre en flux Identification dune fraction cellulaire capable de reconstituer lhématopoïèse : contient les cellules souches –Cellules quiescentes –Très rares: ~1/ cellules –Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-) –Capables deffluer des colorants (Rhodamine, Hoechst) par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1 –Expriment (CD34+), CD133, c-kit

29 Caractéristiques des CSH Dans la M.O, le nombre de CSH reste relativement constant en labsence de perte de sang ou dautres traumatismes Létat de quiescence corrèle avec leur caractère multipotent 2 modèles pour expliquer lhoméostasie de lhématopoïèse

30 Modèle A: Dans des conditions normales, ces CSH sont quiescentes (G0 du cycle cellulaire), mais se divisent régulièrement, – pour assurer la maintenance du pool de CSH –Permet déviter dacquérir des mutations conduisant à leur transformation maligne –Division asymétrique: 1CSH => 1CSH + 1 cellule qui va sengager dans la différencation Linheng

31 –1 pool de CSH « dormantes », qui gardent la capacité de dactivité de cellule souche multipotentes –réagissant aux besoins suscités par lorganisme –revenant à létat dormant une fois les lésions réparées Linheng Modèle B:

32 Wilson cell 2008 Population capable de reconstituer lhématopoïèse: Différents sous types, plus ou moins en cycle

33 Wilson, Cell décembre Injection de BrdU dans les souris à un instant donné -Le BrdU sintercale dans lADN qui devient fluorescent -Suivi du contenu en BrdU par cytométrie en flux

34 Modèle B: synthèse Linheng

35 Organisation de la moelle hématopoïétique

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37 À linterface os/moelle: Les ostéoblastes: -fabriquent la trame osseuse -supportent le développement des CSH: *Un déficit ostéoblastique entraîne une diminution importante de lhématopoïèse (Visnjic, 2004) *La co-transplantation de dostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000) Cellules souches Lin- : -marquées à la fluorescéine - Injectée à une souris témoin -analyse 15h après Localisation des cellules souches au niveau de lendostéum, au contact des ostéoblastes => Interactions préférentielles Nilsson, S. K. et al. Blood 2001 Niche ostéoblastique

38 La niche hématopoiétique « adulte » -contacts physiques-

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40 La niche hématopoiétique « adulte » Ang1

41 La niche hématopoiétique « adulte »

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43 CXCL12 SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE Noradrénaline pleraxifor

44 « Synapse » ostéoblaste - CSH

45 Synthèse Les CSH intègrent des signaux qui proviennent de linteraction avec: – les ostéoblastes, les cellules réticulaires (mésenchymateuses) –mais aussi du micro-environnement médullaire qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse –Les cellules en cours de différenciation comment peut sopérer la différenciation et lexpansion des cellules hématopoïétiques?

46 Etapes de la régulation de lhématopoïèse CSH indifférenciée multipotente Quiescence Auto-renouvellement Engagement Différenciation Maturation Cellules hématopoïétiques différenciées

47 Hierarchie de lhématopoïèse

48 Cultures à long terme (5 semaines) Formation de colonies (10-21 jours) in vitro in vivo Reconstitution lympho-myéloïde. Cellules souches Progéniteurs déterminés Progéniteursimmatures MyéloïdesLymphoïdes in vitro Le système hématopoïétique (4 mois) CD34 + Cellules identifiables morphologiquement 99% 0,5 à 1% 0,01% 0,0001% *: Facteurs de croissance * * SCID-RC LTC-IC CFC

49 Cultures à long terme (5 semaines) Formation de colonies (10-21 jours) in vitro in vivo Reconstitution lympho-myéloïde. Cellules souches Progéniteurs déterminés Progéniteursimmatures MyéloïdesLymphoïdes in vitro Le système hématopoïétique (4 mois) CD34 + Cellules identifiables morphologiquement 99% 0,5 à 1% 0,01% 0,0001% *: Facteurs de croissance * * SCID-RC LTC-IC CFC

50 Cultures à long terme (5 semaines) Formation de colonies (10-21 jours) in vitro in vivo Reconstitution lympho-myéloïde. Cellules souches Progéniteurs déterminés Progéniteursimmatures MyéloïdesLymphoïdes in vitro Le système hématopoïétique (4 mois) CD34 + Cellules identifiables morphologiquement 99% 0,5 à 1% 0,01% 0,0001% *: Facteurs de croissance * * SCID-RC LTC-IC CFC

51 Cultures à long terme (5 semaines) Formation de colonies (10-21 jours) in vitro in vivo Reconstitution lympho-myéloïde. Cellules souches Progéniteurs déterminés Progéniteursimmatures MyéloïdesLymphoïdes in vitro Le système hématopoïétique (4 mois) CD34 + Cellules identifiables morphologiquement 99% 0,5 à 1% 0,01% 0,0001% *: Facteurs de croissance * * SCID-RC LTC-IC CFC

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53 Comment ces mécanismes se mettent-ils en place? Régulation simultanée: –Auto-renouvellement de la CSH –Engagement dans la différenciation –Spécification de la lignée –Homéostasie Mécanismes: –Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque) –Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de croissance

54 INDUCTION ET MISE EN ROUTE DU PROGRAMME DE DIFFERENTIATION

55 microRNAs Engagement cellulaire Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcription Contrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines

56 CSHCLPCMP NOTCH-1, Bmi-1 GATA-2, HOX-B4 PU-1, GATA-1 Régulation transcriptionnelle au cours des premiers stades de lhématopoïèse. Progéniteur myéloide commun Progéniteur lymphoïde commun

57 Facteurs de transcription et cytokines PU.1: facteur de transcription myéloïde PU.1 réprimé par MafB La fixation de M-CSF induit lexpression de PU- 1, sous linfluence de nombreux événements: –Intinsèques –Épigénétiques –externes Sarrazin et al., Cell, 2009

58 Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription De la cellule soucheà la cellule différenciée

59 Kaushansky, NEJM, 2006, De la cellules soucheDe la cellules souche De la cellule souche à la cellule différenciée Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance

60 Facteurs de croissance hématopoïétiques glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères) synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO, qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes, cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines » Redondance Synergies : –Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des progéniteurs –Réponses prolifératives additives –Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires différentes. action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine. Agissent sur un récepteur spécifique: –Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -). –dimérisation du récepteur –transduction d un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines associées vers le noyau –activation de la transcription de gènes donnés

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63 Facteurs de promotion et de survie cellulaire, ex: – Stem cell factor (SCF) = kit ligand: – Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes – Croissance des progéniteurs immatures myéloides et erythroblastiques avec dautres cytokines – Indispensable à lerythropoièse fœtale (foie) – FLT-3 ligand: – Croissance des progéniteurs immatures myéloides et mégacaryocytaires Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1)

64 Facteurs de prolifération et de différenciation, ex: – Non spécifiques de lignée: – Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse – Interleukine 6 sur tous les progéniteurs – Spécifiques de lignée: – Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF – lignée éosinophile : IL-5 – lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo) – lignée méga : thrombopoïétine (Tpo) – lignée lymphocytaire : – maturation : IL-2, IL-4, – croissance : IL-7 – différenciation plasmocytaire : IL-6 Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2)

65 Kaushansky, NEJM, 2006, Modèle de lhématopoïèse De la cellules soucheDe la cellules souche De la cellule souche à la cellule différenciée

66 Régulation négative de lhématopoièse TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de croissance MIP 1a (Macrophage-Inflammatory Protein 1a ) ne limite pas son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de nombreux processus inflammatoires. Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS 1-3, CIS) –La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro (apparition de mRNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles par les cytokines comme IL2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-, EPO, G- CSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.

67 Mode daction des protéines SOCS

68 Synthèse de la différenciation des CSH CSPH médullaires qui vont se différentier vers –polynucléaires PNN ou PNE ou PNB, –Globules rouges (GR) –Mégacaryocytes (plaquettes) –Lymphocytes (B,T, NK) action intriquée de nombreux facteurs –Facteurs de croissance, interleukines –Molécules dadhésion –Facteurs de transcription 2 modèles détude: –Par les gènes spécifiques de la lignée –Par les déficits Pathologies Souris KO


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