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HISTORIQUE La Valette St-George1865 Golgi1896-1910 (PN 1906 avec Cajal) Cajal1910-1920 Dalton & Felix (M.E.)1954 DÉFINITION Ensemble déléments complexes,

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1 HISTORIQUE La Valette St-George1865 Golgi (PN 1906 avec Cajal) Cajal Dalton & Felix (M.E.)1954 DÉFINITION Ensemble déléments complexes, les dictyosomes, reliés entre eux par des systèmes tubulo-vésiculaires. Un dictyosome est constitué par un empilement de saccules clos lisses, inclus dans une matrice protéique (les GMP Golgi Matrix Protein). Ensemble responsable de phénomènes - de GLYCOSYLATIONS, - de SULFATATIONS, - dADRESSAGES de VÉSICULES ASPECTS en MICROSCOPIE PHOTONIQUE

2 Dessins originaux de Camillo Golgi de « lapparato reticolare interno » tel quil lobserva dans un neurone de chat (1898)

3 La DIFFICULTÉ MAJEURE : Faire coïncider ces images avec…

4 Microscopie électronique dun appareil de Golgi (cellule C thyroïdienne) Ça …

5 APPAREIL de GOLGI

6 DICTYOSOME TUBULES VESICULES SACCULES GOLGIENS

7 ORGANISATION dun DICTYOSOME RÉSEAU TRANS-GOLGIEN GOLGI TRANS GOLGI MEDIAN GOLGI CIS ERGIC REG MICROTUBULES Limites … Structure… Sacs maintenus ensembles par : - les microtubules protéines CLIMP, - des protéines membranaires périphériques diverses: GRASP, GMPs, etc. : les golgines Toutes protéines phosphorylables par kinases (cdk)

8 GOLGI & TRANFERTS Ancienne question toujours sans réponse définitive : Comment les produits sont-ils déplacés dans les saccules golgiens ? 1ere hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis Schéma des saccules dynamiques Hypothèse retenue jusquaux années 80 puis rejetée car : 1 - un saccule spécifique a toujours la même composition 2 - présente toujours les même enzymes marqueuses membranaires. 2ème hypothèse : Le contenu des saccules se déplace dans les petites vésicules péri-golgiennes sans que les enzymes marqueuses ne quittent leurs saccules respectifs qui restent stables. Schéma de limmobilité des saccules Hypothèse acceptée jusquaux années 2001, puis battue en brèche car : - Les vésicules péri-golgiennes ne semblent pas contenir de matériel de sécrétion. - On y met en évidence diverses enzymes marqueuses. - Mais comment sont transférées les grosses protéines ? 3ème hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis mais avec transferts rétrogrades des protéines marqueuses par de petites vésicules. Hypothèse actuelle…

9 En réalité : on nobserve pas de matériel de secrétion dans les petites vésicules… Comment de plus transférer les grosses protéines dans de petites vésicules… GOLGI & TRANFERTS 2ème hypothèse : compartiments stables mais déplacements vésiculaires

10 GOLGI & TRANFERTS Ancienne question toujours sans réponse définitive : Comment les produits sont-ils déplacés dans les saccules golgiens ? 3ème hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis mais avec transfert rétrograde des protéines marqueuses par de petites vésicules. Hypothèse actuelle… 2ème hypothèse : Le contenu des saccules se déplace dans les petites vésicules péri-golgiennes sans que les enzymes marqueuses ne quittent leurs saccules respectifs qui restent stables. Schéma de limmobilité des saccules Hypothèse acceptée jusquaux années 2001, battue en brèche maintenant car : - Les vésicules péri-golgiennes ne semblent pas contenir de matériel de sécrétion. - On y met en évidence diverses enzymes marqueuses. - Mais comment sont transférées les grosses protéines ? 1ere hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis Schéma des saccules dynamiques Hypothèse retenue jusquaux années 80 puis rejetée car : 1 - un saccule spécifique a toujours la même composition 2 - présente toujours les même enzymes marqueuses membranaires.

11 GOLGI & TRANFERTS 3ème hypothèse : Déplacement des saccules retour des protéines résidentes par vésicules

12 LES TRANSFERTS GOLGIENS Lysosomes Giantine p115 GM130 GRASPs Clathrine Complexe dancrage REG ERGIC Golgi médian Golgi Trans Réseau Trans Golgi Golgi Cis Grains de sécrétion Sar1 t-SNARE :Syntaxine 5 Golgi ReAssembly Stacking Protein COP I/Rab1 phosphorylable COP II Soluble N ethylmaleimide Attachment protein REceptor COP I/Arf1 ? COP I/Arf1

13 COPII Sar1 + Dynéine-dynactine Cis-GolgiGolgi médianTrans-Golgi ERGIC Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment REG COPI + - Kinésine pH 7 5,5 Protéine sécrétoireRécepteur KDELProtéine résidente avec séquence KDEL Arf1 Existence réelle?

14 LES TRANSFERTS GOLGIENS Lappareil de Golgi est une structure dynamique : 1 – Le blocage des transferts à partir du REGDÉSINTÉGRATION 2 – La phosphorylation de GM130DÉSINTÉGRATION Survient normalement lors de la prophase GM130 est associée à Giantine p115 dans le complexe dancrage Les rétro-transferts vers le REG : 1 – par lintermédiaire de vésicules type COP I, 3 – concernent les protéines solubles résidentes du REG à motif KDEL 4 – grâce à un récepteur membranaire spécifique (ERD2 ou KDEL-R) 5 – mécanismes de reconnaissance du complexe ERD2+KDEL inconnus 2 – intervention de la petite protéine Rab1 et de sa GAP, par diminution de la température, par blocage de Arf1 par destruction des MT Dautres systèmes de rétro-transferts sont suspectés mais non encore identifiés

15 RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE APPAREIL de GOLGI LYSOSOMES ENDOSOMES PRÉCOCES ENDOSOMES TARDIFS ESPACE EXTRA-CELLULAIRE SECRÉTION CONSTITUTIVE COP2 Sar1 Clathrine COP1 Arf1 COP1 Clathrine Cavéolines ? SECRÉTION RÉGULÉE VÉSICULES SECR É TOIRES

16 LES GLYCOSYLATIONS SULFATATIONS ADRESSAGE des PRODUITS ÉLABORÉS CLIVAGES PROTÉIQUES Grains de sécrétion & lysosomes Excrétion constitutive versus Excrétion régulée LES RAPPORTS AVEC LE RÉSEAU TRANS-GOLGIEN PHOSPHORYLATIONS SYNTHÈSES LIPIDIQUES

17 LES GLYCOSYLATIONS ERGIC FACE CIS GOLGI MEDIAN FACE TRANS R.T.G. REG ADDITION N-ACÉTYL-GALACTOSAMINE ADDITION GALACTOSE ACIDE SIALIQUE ADDITION ACIDE SIALIQUE Beaucoup plus complexes que celles du REG Sont séquentielles : localisation spécifique de chaque enzyme. Formation des - protéoglycanes - glycoprotéines Présence de transporteurs à ces différents sucres dans les membranes. Indispensables à lexcrétion : - Contrôle de qualité - Signal de sortie au pôle apical dans la cellule polarisée Modalité de protection contre diverses protéases: le glycocalix les mucus Système de reconnaissance : - penser aux groupes sanguins… RÔLES

18 FONCTIONS de lAPPAREIL de GOLGI PHOSPHORYLATION MANNOSES LYSOSOMAUX ADDITION N-ACÉTYL GALACTOSAMINE ADDITION GALACTOSE ACIDE SIALIQUE ADDITION ACIDE SIALIQUE FORMATION DES LYSOSOMES Thiamine pyrophosphatase Osmium RETOUR DU MATÉRIEL DENDOCYTOSE EXCRÉTION RÉGULÉEEXCRÉTION CONSTITUTIVE CLIVAGES PROTÉIQUES Les CONVERTASES N-acétyl glucosamine phosphotransférase N-acétyl glucosaminidase ACIDIFICATION DES LUMIÈRES par ATPase Sulfotransférases Galactosyl transférases Sialyl transférases

19 Injection de Rappel : Lapparition dun bruit de fond, de murmures diffus Cours considéré comme fait, supposé connu et pouvant faire lobjet de diverses QCM lors du concours… IL NY AURA AUCUN AUTRE AVERTISSEMENT !!!

20 1 - ATPases IONIQUES : Na + /K + ATPase : 2 2, à 7 traversées, à une seule Ubiquitaire, consomme 1/3 de lATP produit, expulse 3 Na + contre 2 K + Membranes plasmique & réticulaires Ca ++ ATPase : Vésicules de sécrétion, endosomes tardifs, réseau trans-golgien Membranes mitochondriales internes, membranes bactériennes… H + ATPase : H + /K + ATPase : Membrane plasmique cellule bordante stomacale De type « P » (plasmique): De type « V » (vacuolaire) : Les ATPases 2 - ATPases ABC (ATP Binding Cassette) Membrane plasmique. Divers métabolites, les sels biliaires, les xénobiotiques. Protéines MDR (MultiDrug Resistance), MRP (Multidrug resistance Related Protein), CQR Membrane plasmique. Transfert du chlore et mucoviscidose Protéine CFTR : Transfert des antigènes générés dans le cytoplasme vers les membranes réticulaires avant délivrance à la membrane plasmique Protéines TAPs (Transport associated Antigene Processing) PMP 70 : Peroxysomes Proteines APC (acides Aminés, Polyamines, Cations) : lysosomes 3 - ATPases AAA (ATPases associées à diverses activités) Protéolyse dans le protéasome, Désassemblage tSNARE vSNARE (NSF) Désassemblage fuseau mitotique en fin de mitose En partie responsable de la polarité membranaire

21 A B BH G C D F C Matrice Cytoplasme Schéma dune ATPase vacuolaire Schéma dune ATPase ABC Sites de fixation de lATP « cassette »

22 RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire car - Recueil des vésicules dendocytose, - Émission des lysosomes, - Émission des grains de secrétion : secrétion régulée, vers le pôle excrétoire - Émission de vésicules diverses secrétion non régulée, vers toute la membrane plasmique vers divers systèmes membranaires 1 - Recueil des vésicules dENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées. LES CAVEOLAE Distribution finale vers les lysosomes + LES RAFTS, VÉSICULES LISSES, PHAGOSOMES

23 LES VÉSICULES à CLATHRINE Schéma dune molécule de clathrine (triskel) composée par 3 chaînes lourdes et 3 chaînes légères Géométrisation de larrangement des triskels de clathrine pour former une vésicule bordée Invagination dun plateau bordé formant un puits bordé.Vésicule bordée

24 Formation dune vésicule à clathrine

25 FORMATION dUNE VÉSICULE à CLATHRINE Mb TGN ou Mb plasmique Protéine destinée à lexcrétion Signal di-leucine de sortie Peut être remplacée par un complexe ligand-récepteur Protéine AP Petite Protéine G Protéine accessoire régulant la fixation de la clathrine Triskel de clathrine ATTENTION : les petites protéines G et les protéines dadaptation sont spécifiques de la localisation

26 Attention : schémas précédents un peu simplistes Nont pas été représentées : certaines petites protéines G les v-SNAREs Origine de ces vésicules : Membrane plasmique Membranes TGN lysosomes & grains de sécrétion Intervention de la dynamine dans lisolement de ces vésicules bordées Protéine GTPasique PRODUITS INCORPORÉS : Hormones : Insuline, Glucagon, Prolactine Calcitonine, TSH, GH, LH Toxines : diphtérique, anthrax, de Pseudomonas, botulique et tétanique Facteurs de croissance : NGF, EGF, PDGF, Interférons Virus : grippal, HIV, forêt de Semliki, stomatite vésiculaire … Protéines plasmatiques de transport : transferrine, transcobolamine, LDL Immunoglobulines LES VÉSICULES à CLATHRINE Tous ces composés sont incorporés après fixation sur un récepteur

27 RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire : 1 - Recueil des vésicules dENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées. LES CAVEOLAE Distribution finale vers les lysosomes

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29 Cryo-décapage après ultracongélation : membrane plasmique, versant cytoplasmique

30 LES CAVEOLAE Petites dépressions en forme d renversé sur la membrane plasmique Ubiquitaires mais +++ dans adipocytes, fibroblastes, cellules et fibres musculaires, endothélium vasculaire, pneumocytes, cellules épithéliales. Les « RAFTS » : domaines particuliers de diverses membranes (plasmique, R.E. Golgi) enrichis en cholestérol et glycolipides mais sans cavéoline à ce niveau, membrane plus épaisse. Les CAVÉOLINES :3 isoformes (18 à 24 kDa) : cavéolines 1 & 2 ubiquitaires cavéoline 3 uniquement musculaires en forme dépingle à cheveu avec 2 extrémités cytoplasmiques capables de fixer les MF dactine par intermédiaire de la filamine fixent le cholestérol libres dans le cytoplasme, peuvent transférer des stéroïdes Une trentaine de récepteurs divers sont associés à ces rafts ou caveolae Cholestérol et sphingolipides, protéines ancrées sur des glycolipides (prot. à ancre GPI) protéines spécifiques, les cavéolines Riches en Les caveolae ne distribuent pas leurs ligands aux lysosomes, participent aux phénomènes de transcytose, peuvent fusionner directement avec le RE, et…. Toxines cholérique, botulique, tétanique, HDL, SV40, Ig, Sont considérées comme des protéines à manteau

31 LE COMPARTIMENT ENDOSOMAL Définition : Ensemble de structures tubulo-vésiculaires originaire de la membrane plasmique. Compartiment progressivement acidifié par des v-ATPases Origine et filiation Plateaux bordés vésicules à clathrine Caveolae Vésicules lisses Radeaux lipidiques Macropinocytose macropinosome Phagocytose phagosome Endosomes précoces Endosomes précoces de triage Corps multivésiculaires Vésicules lisses Endosomes tardifs de triage Corps résiduels Lysosomes pH 7 5

32 PETITES PROTEINES G GTP GDP LE COMPARTIMENT ENDOSOMAL Endosomes précoces Endosomes « moyens » Endosomes « tardifs» (C.M.V.) Lysosomes Corps résiduels pH 7,2 654 TGN ATP H+H+ ADP Rab5 Rab11 Rab7 Enzymes lysosomales C.M.V. : Corps multivésiculaires Rab4 Endosomes de recyclage

33 Lysosome Endosome précoce Endosome moyen Corps multivésiculaire Ubiquitine Lipases Protéases Récepteurs Ligand Formation dinvaginations membranaires Recyclage des récepteurs non ubiquitinylés De limportance de la formation des corps multivésiculaires Si ce phénomène nexistait pas, la destruction des récepteurs ne pourrait être que partielle, laissant les segments intra- cytoplasmiques non détruits Ajout de diverses protéines : - membranaires : navettes des matériaux dégradés, ajout pompe protons spécifique, - solubles : enzymes lysosomales

34 CORPS MULTIVÉSICULAIRES

35 RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire : 1 - Recueil des vésicules dENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées. LES CAVEOLAE Distribution finale vers les lysosomes 2 – Emission de VÉSICULES dEXOCYTOSE : LES RAFTS, VÉSICULES LISSES, PHAGOSOMES

36 RÉSEAU TRANS-GOLGI CLATHRINE : COP I CAVÉOLINE Grains de sécrétion Lysosomes Divers récepteurs CLATHRINE Sécrétion régulée Sécrétion constitutive EXOCYTOSE Maturation granulaire ? ATP ADP H+H+ D D D D D = Dynamine pH5,56,557 H+H+ Rétrotransferts COP I vers Golgi vers RE E N D O C Y T O S E Plateaux & Puits Bordés (Clathrine) Endosomes Rafts & cavéoles ?

37 EXCRÉTION RÉGULÉEEXCRÉTION CONSTITUTIVE Toujours au même pôle cellulaire Sous linfluence dun signal Est précédée de la « maturation » du granule : action des convertases départ pompes à protons fusions granulaires éventuelles Renouvellement de la membrane plasmique du pôle excrétoire Vers toute la membrane plasmique Continue Utilise des tSNAREs spécifiques Renouvellement des composants protéiques de la membrane plasmique Ne pas oublier : la membrane plasmique na pas partout la même composition Dans les cellules épithéliales, les complexes de jonction constituent une barrière à la diffusion des protéines dans le plan membranaire. Question : le contrôle de cette différence….

38 TRAFIC VÉSICULAIRE COMPARTIMENT INTERMEDIAIRE

39 LEXOCYTOSE Mécanismes par lesquels des produits délaboration stockés dans une vésicule sont expulsés hors de la cellule. Mécanismes nécessitant : - une reconnaissance entre vésicule et membrane plasmique, - un accolement des systèmes membranaires - une fusion de ces membranes. Interviennent fondamentalement 4 familles de protéines : - Les protéines SNAREs (Soluble NSF Attachment protein REceptor) les t-SNAREs sur la membrane plasmique, (t pour « target ») les v-SNAREs sur les membranes vésiculaires (v pour « vesicular ».) ces deux protéines étant complémentaires lune de lautre - De petites protéines G : les protéines Rab spécifiquement localisées dans la cellule, présentant des spécificités pour certaines vésicules, possédant des « récepteurs » spécifiques sur certaines membranes. - Le complexe dit NSF (ATPase AAA) - Des protéines de fusion.

40 Les protéines SNAREs Une vingtaine de SNAREs sont actuellement connues protéines transmembranaires caractérisée par des domaines hélicoïdaux cytoplasmiques caractéristiques existent sous la forme de couples complémentaires: formation de complexes tSNARE-vSNARE stables RabxRabx-R t-SNAREv-SNARE Protéines de fusion Membrane plasmique GEP Rabx-GDP Rabx-GTP

41 NSF : N ethylmaleimide Sensitive Factor (ATPase AAA) Protéine SNAP: Soluble NSF Attachment Protein Modalités de retour vers le compartiment dorigine ???

42 - les t-SNAREs - les v-SNAREs Ces protéines concourrent à empêcher des fusions vésiculaires entre deux systèmes membranaires non apparentés en coopération avec les protéines Rab. Existent sur tous les systèmes membranaires vésiculaires et plasmique. cibles de certaines toxines - Les protéines de fusion : mal connues actuellement chez les Eucaryotes mais mieux connues chez certains virus : elles permettent lentrée de ce dernier dans la cellule-cible. - Les petites protéines G de la famille Rab : elles assurent en partie la spécificité des fusions entre 2 membranes spécificité étant aussi assurée par le complexe t-SNARE et v-SNARE Ce qui est fondamental : Physiopathologie de certaines maladies Rab1 : Golgi & RE Rab2 : cis Golgi Rab3 : vésicules de secrétion Rab4 : endosomes précoces Rab7 endosomes tardifs Rab8 : excrétion constitutive

43 Toxine tétanique : Toxine botulique : ENDOPEPTIDASES pouvant cliver SNAP Syntaxine synaptobrévines Toxines botulique et tétanique sattaquant à des synapses différentes signes cliniques différents Métalloprotéases à zinc bi caténaires (une chaîne lourde, une chaîne légère reliée par un pont disulfure) endocytées par les plateaux bordés, les caveolae, chaîne légère transloquée hors du compartiment endosomal clive alors une des trois protéines Clostridium botulinum, anaérobie strict Incubation : 5 à 30 heures Douleurs abdominales, vomissements Paralysies flasques dabord oculaires pouvant se généraliser (T.D. puis membres) Paralysie respiratoire mort en 2 à 6 jours Plectridium tetani, anaérobie strict Incubation : 5 à 8 jours Contractures douloureuses des muscles : trismus : contracture des masséters opisthotonos: contractures généralisées Paralysie des muscles respiratoires mort en 2 à 6 jours tSNAREs de la membrane présynaptique

44 - les t-SNAREs - les v-SNAREs Ces protéines concourrent à empêcher des fusions vésiculaires entre deux systèmes membranaires non apparentés en coopération avec les protéines Rab. Existent sur tous les systèmes membranaires vésiculaires et plasmique. cibles de certaines toxines - Les protéines de fusion : mal connues actuellement chez les Eucaryotes mais mieux connues chez certains virus : elles permettent lentrée de ce dernier dans la cellule-cible. - Les petites protéines G de la famille Rab : elles assurent en partie la spécificité des fusions entre 2 membranes spécificité étant aussi assurée par le complexe t-SNARE et v-SNARE Ce qui est fondamental : Physiopathologie de certaines maladies Rab1 : Golgi & RE Rab2 : cis Golgi Rab3 : vésicules de secrétion Rab4 : endosomes précoces Rab7 endosomes tardifs Rab8 : excrétion constitutive

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