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Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine PERSPECTIVES DAMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE.

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1 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine PERSPECTIVES DAMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE

2 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine INTRODUCTION INCOMPATIBILITES RHD FOETO-MATERNELLES EN FRANCE INCIDENCE estimée (pour 1000 naissances) MORTALITE estimée & MORBIDITE SEVERE à 6 12% des cas Prévention Rh ciblée Baisse de lindice de fécondité Dépistage biologique Médecine néonatale Échographie fœtale Transfusions fœtales IV ,8 4% des cas

3 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine Taux cumulés d immunisation anti-D en fin de grossesses chez la femme Rh négatif Spontané Après Ig Rh post partum seulement + Ig Rh ante partum systématique Nº1Nº2Nº3Nº4Rang de grossesse IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Efficacité

4 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Le Principe Actif Basée sur lutilisation dimmunoglobulines polyclonales anti-D (IgRh) : -Seule source : fractionnement de plasma humain, contenant un titre élevé danticorps dirigés contre lantigène RhD -Plasma humain : fourni par des donneurs RH-, hyperimmunisés par injections répétées de globules rouges RH+(rémunérés) 97 % de plasmas collectés aux Etats-Unis -Spécialité commercialisée en France : RHOPHYLAC R (LFB : laboratoire Français du fractionnement et des Biotechnologies)

5 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Mécanismes possibles 3 MECANISMES POSSIBLES : Tous dépendent de la formation dun Immun-complexe IgG anti-D Antigène RhD I- Masquage des épitopes RhD par saturation des sites antigéniques RhD. II- Inhibition des lymphocytes B spécifiques par interaction entre le RFc IIb lymphocytaire et le segment Fc des IgG anti-D. III- Destruction antigénique par clairance macrophagique très rapide des globules rouges RhD+

6 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Inconvénients - Médicaments dérivés du sang : - Mesures maximales en matière de sécurité virale et autres agents infectieux (pour octroi dAMM par Afssaps)… néanmoins toujours possibilité de transmission dagents non répertoriés - Règles de traçabilité - Information systématique des patientes concernant un médicament dérivé du sang (nature des produits utilisés, risques liés à leur utilisation, mesures de sécurité prises pour la fabrication des produits) - Liés au mode de préparation de ces Ig anti-D : - Problème dapprovisionnement en plasmas hyperimmuns -Problème dordre éthique liés à limmunisation de sujets volontaires sains

7 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives 1- Ig MONOCLONALES Actuellement limmunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % dentre elles portent un enfant RH-

8 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine Anticorps monoclonaux humains Transformation de lymphocytes humains par lEBV Ac 1 2 EBV clonage sélection lymphocytes B transformés cellules mononucléées Biologie moléculaire : Ac Mo humains recombinants Souris humanisées : greffe des loci IgG humains lignées B IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production dIg MONOCLONALES

9 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine ADNc Lymphocytes B (EBV) PCR L H Vecteur dexpression Transfection CHO Lignées cellulaires : BHK NS0… anticorps recombinants ARN Clonage PRINCIPE IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production dAnti-D recombinants

10 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALES CANDIDAT IDEAL 1- AFFINITE +++ pour lantigène RhD (rendement de fixation, saturation des épitopes) 2-SPECIFICITE+++ pas de réaction croisée avec une autre cible antigénique 3- SENSIBILITE+++ reconnaissance dun maximum de variant 4- PHARMACOCINETIQUE équivalent à une IgG polyclonale 5- FORT POTENTIEL dactivation des récepteurs Fc Importance de la glycosylation post-traductionnelle

11 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALES TESTS FONCTIONNELS Pour mesurer la fixation des IgG anti-D aux différents récepteurs Fc Mesure ADCC (antibody/dependent/cellular/cytotoxicity), permet la mesure des interactions avec le récepteur Fc RIIIa Ag Fc RI Fc RII Fc RIII Ac IgG Lyse Lymphocyte

12 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Test de clairance des hématies IgG polyclonales Volontaire RhD- injection de 1,5 ml de GR RhD+ marqués au Cr51 Injection de 10 g de poly D H0 Injection de 100 g de poly D H50 T 1/2 : 18h pour 10 g T 1/2 : 3h pour 100 g IgG monoclonales Volontaire RhD- injection de 1,3 ml de GR RhD+ marqués au Cr51 Injection de 871 g de MONO-D T 1/2 : 13,7 jours 100 g 10 g Etude Yves Brossard CNRHP

13 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine AD1+AD3 Poly-D Poly-D : n=4 AD1+AD3: n=8 Time Test de survie des GRs AD1+AD3 mAbs AD1+AD3 : clairance moins rapide et incomplète par rapport à celle obtenue avec les Ig polyclonales anti-D Etude clinique :sujets Rh -, hématies Rh + Cr 51, Ig polyclonale anti-D WinRh0, Ac monoclonaux humains AD1+AD3 (V:V) (1996) IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS 1ers anticorps

14 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine R297 anticorps monoclonal du LFB Excellente clairance en comparaison avec un anti-D polyclonal I.V. injection of autologous 51 Cr RhD + RBC into male volunteers: - 51 Cr RBC only, n= Cr RBC 25% saturation with marketed Poly-D antibodies, n= Cr RBC 25% saturation with Emabling® R297 anti-RhD mAb, n=7 51 Cr RBC only #1 51 Cr RBC only #2 Marketed poly-D #3 R297 #8 R297 #9 R297 #10 Marketed poly-D IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Clairance des GRs marqués au 51 Cr

15 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES Plusieurs anticorps monoclonaux sont en cours de développement et ont été évalués en clinique : - Rheseclone : Russie, produit par une lignée lymphoblastoïde EBV, aucune donnée disponible - BRAD-3 (IgG3) et BRAD-5 (IgG1) Royaume Uni par BPL (Bioproduct Labratories) seuls ou en association : capable dinduire une immunosupression chez des sujets RhD- ayant reçu des GR RhD+, mais clairance des hématies moins rapide que les Ig polyclonales - MonoRh0 : Suisse, ZLB-CSL : testé chez volontaire Rh négatif immunosupression bien clairance dhématies RhD+ injecté beaucoup plus faible quavec le Rhophylac R - R597 : France, LFB, sélection d un anticorps humain monoclonal recombinant sur la base de son activité fonctionnelle : Forte liaison aux récepteurs Fc RIII, activation des cellules NK avec lyse des hématies RhD+, clairance dhématies RhD+ aussi rapide que Rhophylac R

16 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES INCONVENIENTS : -Problème des résistances éventuelles : développement danti-idiotype -Pour prouver efficacité et pour envisager de remplacer les IgG polyclonales : besoin dune évaluation à grande échelle

17 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives 2- GENOTYPAGE Actuellement limmunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % dentre elles portent un enfant RH-

18 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh Protéine RHD : protéine transmembranaire du Globule Rouge sites par GR RhD+

19 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LA PROTEINE RHD

20 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH Isolement et séquençage du gène RHD par léquipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis. Blood 1991 ; 28 :

21 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Liquide amniotique - Plasma I - Génotypage RHD fœtal réalisable sur lADN des cellules amniotiques (année 90) P.R. BENNET et al. N.eng.J.Med. 1993; 329: J.T. AUBIN et al. Br J Haematol 1997 ; 98 (2) : Diagnostic invasif II – Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD – Suite à la découverte de la présence dADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes (1 à 6 % dADN dorigine fœtale sous forme acellulaire) LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : Diagnostic non invasif Limite du test : femme ne doit pas posséder dans leur génome des séquences non exprimées du gène RHD.

22 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel ADN fœtal dans le plasma Quantité de Génomes (par ml de plasma maternel) 25 (3 à 70) à 15 S.A. 290 (77 à 769) à terme Isolement Rapide, simple Persistance in vivo Demi-vie < 1 heure

23 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL INTERET I- GROSSESSES AVEC IMMUNISATION ANTI-D Diagnostic dIncompatibilité foeto-maternelle RhD (environ 1000 cas / an en France avec 90% de fœtus Rh+) II- GROSSESSES SANS IMMUNISATION ANTI-D : Cibler limmunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI itératives aux seules femmes Rh - avec fœtus Rh+ (environ femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+) Validation du génotypage non invasif par une étude portant sur 851 femmes enceintes au CNRHP C. Rouillac-Le Sciellour et all Large scale Pre-Diagnosis study of Fetal RHD Genotyping by PCR on plasma DNA from RhD-negative Pregnant women. Mol Diagn 2004 ; 8;

24 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE -Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml), 48h max entre prélèvement et réception au laboratoire -Centrifugation puis décantation plasma -Extraction de lADN plasmatique -Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD : - exon 7 ( plus spécifique mais moins sensible) - exon 10 (plus sensible mais moins spécifique) -Les 2 amplifications distinctes permettant daugmenter la sensibilité du test et détecter un maximum de variant du système RH SI FŒTUS RH- REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT Concentration plus élevée dADN fœtal 2) Rattraper une erreur détiquetage 3) Rattraper un croisement per-analytique des échantillons

25 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EVOLUTION Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE (INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY) Trousse développée en Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter fluorescent.Marquage CE obtenu en JUIN 2007 Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman Projet STIC : Génotypage RHD fœtal non invasif systématique Paris-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes OBJECTIFS MEDICO-ECONOMIQUES: -Diminution des injections inutiles dIgRH et des RAI chez les femmes avec fœtus Rh négatif ? - Amélioration de la compliance à la prévention Rh anténatale, ciblée ou systématique chez les femmes avec fœtus Rh positif ? - Evaluer la faisabilité et le coût dun programme de Génotypage fœtal RH systématique dans le cadre actuel du suivi prénatal en France.

26 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement : Dans un laboratoire autorisé par lAgence Régionale dHospitalisation, après avis de lAgence de Biomédecine. Par des biologistes agrées par lAgence de Biomédecine.


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