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Outils biologiques hématologiques 1) Morphologie 2) Cytométrie en flux –immunophénotype –cycle cellulaire 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire.

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1 Outils biologiques hématologiques 1) Morphologie 2) Cytométrie en flux –immunophénotype –cycle cellulaire 3) Cytogénétique conventionnelle et moléculaire 4) Biologie moléculaire

2 1) Morphologie Frottis sanguin myélogramme cytochimie

3 2) Cytométrie en flux Technologie permettant de faire défiler des cellules à grande vitesse dans le faisceau d un laser la lumière ré émise (diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant différents critères et de les trier la lumière diffusée renseigne sur le contenu de la cellule (granularité) la lumière absorbée proportionnellement au diamètre de la cellule (taille) la fluorescence est apportée par un fluorochrome qui absorbe l énergie du laser et émet une fluorescence dans une longueur d onde différente –fluorochrome avec affinité pour l ADN (contenu en ADN) –fluorochrome fixé sur un anticorps

4 Cytomètre en flux De 1 à 8 Ac incubés avec les cellules

5 Applications de la cytométrie en flux: 1) immunophénotypage Couplage d un fluorochrome sur un Ac si l Ac se fixe sur une cellule: mise en évidence de l expression de l antigène il existe une batterie de fluorochromes émettant à des longueurs d onde différentes (couleurs) les analyseurs peuvent étudier jusqu à 8 couleurs simultanément, donc 8 marqueurs potentiellement permet de déterminer la densité antigénique à la surface (ou intracytoplasmique) des cellules

6 Spécificité des marqueurs Marqueur pan-leucocytaire: CD45 cellules immatures: CD34, CD117, HLA-DR, TdT cellules myélo/monocytaires: CD13, CD33, CD11b, CD15, CD65 lignée plaquettaire: CD4, CD61, CD42b lymphocytes B: CD19, CD20, CD22, CD10 plasmocytes: CD38, CD138 lymphocytes T: CD3, CD4, CD8, CD5, CD2, CD7 cellules NK: CD16, CD56, CD57

7 Permet le diagnostic des formes pour lesquelles la morphologie seule est insuffisante: –cellules indifférenciées (blastes) –cellules lymphoïdes (score de Matutes) appartenance à une lignée Évalue le degré de différenciation cellulaire diagnostic des HPN (expression CD55 et CD59 sur GR et PN) étude des sous-populations lymphocytaires (CD4 / CD8) sensibilité 1/1000: maladie résiduelle recherche des cibles thérapeutiques: –rituximab – Mabthera® (anti-CD20) –Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52) –gemtuzumab (anti-CD33)

8 Exemple d une leucémie lymphoïde chronique: CD5+ CD19+ kappa

9 Applications de la cytométrie en flux: 2) Contenu en ADN Utilisation de précurseurs fluorescents des bases nucléaires s'incorporant dans le DNA –5-bromo-deoxyuridine ou BrdU –5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd

10 Cytogénétique Conventionnelle: caryotype moléculaire: –FISH –multi-FISH –peinture chromosomique

11 Cytogénétique: 1) Caryotype réalisé sur sang, moelle ou ganglion mise en culture de léchantillon en milieu nutritif (avec ou sans agents mitotiques) durée variable 24H ou 48H, parfois 72H blocage des métaphases choc hypotonique des cellules: éclatement de la membrane nucléaire fixation étalement sur lame, coloration et analyse au microscope: bandes chromosomiques au moins 20 métaphases analysées

12 ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES (DE L'ADN)

13 CONSEQUENCES MOLECULAIRES DES REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLES =>ACTIVATION D'ONCOGENES =>INACTIVATION DE GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR - (ANTIONCOGENES)

14 2) Cytogénétique moléculaire:FISH Hybridation in situ fluorescente (FISH) Visualisation de la région chromosomique couverte par la sonde: –à l échelle d un gène (qq dizaines de kilobases) –à l'échelle d un chromosome: peinture chromosomique plusieurs couleurs possibles: permet de mettre en évidence des anomalies précises au niveau génomique: ex bcr-abl

15 Caryotype (cytogénétique conventionnelle)

16 IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21)IGH/CCND1

17 Peinture chromosomique

18 Multi-FISH

19 Outils moléculaires: PCR +++ PCR standardPCR quantitative sonde fluorescente

20 Place des analyses moléculaires A la différence du caryotype, chaque PCR ne détecte qu une et une seule anomalie intérêt: pas tant sur le diagnostic (cytogénétique) que sur le suivi: maladie résiduelle problème: plusieurs centaines danomalies caractérisées PCR développées sur les anomalies les plus fréquentes examens guidés par les données de la cytogénétique (partenaires de MLL par ex)

21 Fin du diaporama, des exemples suivent

22 Hémopathies lymphoides chroniques

23 LLC Manteau Burkitt L. FolliculaireL. Grandes cell 1) Hémopathies chroniques lymphoïdes B Tous ont réarrangé leur Ig + anomalies spécifiques

24 Identification du réarrangement clonal IgH: Différentes familles de segments V Différentes familles de segments J: ÞPlusieurs types de PCR nécéssaires (séquences consensus) variabilité clonale (mutations): absence de détection (10%) Perte du clone pendant lévolution

25 LNH du manteau et expression de la cycline D1 Non exprimée dans les lymphocytes normaux Conséquence moléculaire de la t(11;14)(q12; q32) (70% des cas au caryotype) Non spécifique du lymphome du manteau: –Leucémie Prolymphocytaire B –Myélome –SLVL CCND1 CCND2 CCND NEG CTRL POS CTRL Sa positivité (taux significatifs) élimine le diagnostic de LLC

26 Hémopathies lymphoïdes chroniques T: Détection des RR du TCR Chronologie des réarrangement TCR –TCR, puis TCR, TCR en dernier Stratégies diagnostiques biologique: –Détection RR et Détection dun clone T (minoritaire) –faux positif? –Clone Réactionnel? –Faible variabilité (V gamma du sujet agé) Pas de translocations analysables par PCR

27 Intérêt de la bio. mol. au diagnostic 1) mise en évidence d une anomalie génétique –en cas de classification difficile: Mise en évidence dune translocation spécifique –IgH-Bcl2, NPM-ALK, … Détection de lexpression anormale dun gène –CCND1 –Point de départ pour létude de la maladie résiduelle 2) étude de la clonalité lymphoïde: –Étude du profil des réarrangements IgH/TCR –doute sur une hyperplasie réactionnelle –pathologies inflammatoires

28 Syndromes myéloprolifératifs LMC Splénomégalie myéloïde Maladie de Vaquez Thrombocytémie essentielle LMMC

29 t(9;22)(q34;q11): fusion entre extrémité 5 de BCR et 3 dABL Points de cassure: -dans ABL: intron 1 ou 2 -dans bcr: M-bcr: p210 (b2a2 b3a2) m-bcr p190 (e1a2) µ-bcr: p230 (e19a2) Récemment: - p200 (e8-int-a2) Leucémie myéloïde chronique

30 Utilité de la biologie moléculaire dans la LMC Diagnostique (+/-) dans les formes complexes –SMP atypique cytologiquement –Phi masqué (CG conventionnelle) Pronostique: quantification –cinétique de disparition du transcrit: pronostique? –Maladie résiduelle –nouvelles thérapeutiques (STI) –greffes

31 Bio. Mol des autres syndromes méloprolifératifs Pas de marqueur clonal (cellules non lymphoïdes) nouveau marqueur JAK2 –>90% des polyglobulies primitives –50% de TE et des MF Analyse de l inactivation de l X peu (pas) employée: –techniques lourdes –réalisables uniquement chez la femme –démontré dans 70% des cas de SMP –faux positifs 25-50% des femmes agées

32 Leucémies aigues Lymphoblastiques Myéloblastiques

33 LA myéloblastiques Classification WHO: –anomalies récurrentes: translocations +++ t(15;17) (PML RARA) 5 - 8% / (LAM3) t(8;21) (AML1- ETO) % / (LAM2) inversion du 16 (CBF -MYH11) 10-12% (LAM4) anomalies du 11q23: MLL 5-6% (LAM0-5) –Autres: classification FAB –+ dysplasie –LA de lignée ambiguë RT-PCRs spécifiques développées

34 LA lymphoblastiques anomalies chromsomiques (oncogéniques) LAL-B –t(9;22) BCR-ABL –t(4;11) AF4- MLL –t(5,14) IL3-IgH LAL-T –HOX11 / HOX11L2 –TAL deletion, SIL- TAL –CALM-AF10 –t(1;19) E2A-PBX1 –t(8;14) cMyc-IgH –t(12;21) ETV6-AML1 –t(11;14) LMO1/2 –t(1;7) LCK –Inv14: TCL1 –…

35 LA lymphoblastiques : réarrangement clonal du récepteur à l Ag Lignée lymphoïde: –B: réarrangement IgH –T: réarrangement TCR Réarrangements illégitimes –Lignée B: réarrangements TCR+++ = Marqueurs de clonalité, en dehors (ou en plus) danomalies détectables

36 Clonalité lymphoïde et LAL Pas dintérêt diagnostique mais identification au diagnostic+++ Suivi = maladie résiduelle = quantification –Genescan –RQ-PCR Protocole GOELAL pilote: –Décisionnel à 10-3 Clonalité TCR

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