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Les techniques histologiques Ou…les principes fondateurs.

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1 Les techniques histologiques Ou…les principes fondateurs

2 Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !…

3 Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit lapparence dun objet. Une lentille est un focalisateur de rayonnement Mais quest ce quun microscope ?… De particules subatomiques : lentille électromagnétique Photonique : lentille en verre ConvexeConcave

4 Mais quest ce quun microscope ?… Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit lapparence dun objet. Une lentille est un focalisateur de rayonnement Un microscope fournit une image, perçue par lœil. Il faut donc obtenir en sortie du microscope des rayons lumineux. Pour fournir une image perceptible, il faut que lobjet modifie le rayonnement. Il peut modifier son amplitude (intensité), sa longueur donde (couleur), ou sa phase.

5 Le premier « microscope… » Janssen, 1595

6 Robert Hooke : lacte de naissance de la cellule Micrographia (1665) « De la structure du liège et des cellules ou des pores de quelques corps spongieux du même genre »

7 Antonin van Leeuwenhoek 1830 à 1860 : la théorie cellulaire Brown (1831) : noyau cellulaire des cellules dorchidée Schwann (1839) : « Recherches microscopiques sur la concordance dans la structure et dans la croissance des animaux et des végétaux » 1674 : « animalcules » 1683 : bactéries REFLECTION TRANSMISSION

8 Le premier Nikon (1900) Un Olympus récent… (1998) Source de lumière Condensateur (Objet) Oculaire Objectif

9 Rétine Quel est donc le principe du microscope ?… LoupeGROSSIR…

10 Rétine Quel est donc le principe du microscope ?… LoupeGROSSIR…

11 Rétine Quel est donc le principe du microscope ?… OculaireGROSSIR… Objectif Grossissement = Objectif x Oculaire

12 Mais comment grossir ?… 10 x 100 = ?…

13 Mais comment grossir ?… RESOLUTION

14 Le grossissement peut se faire sans résolution... Photo de journal Photo de livre dart 100X …si linformation initiale est insuffisante !

15 Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Pour un microscope utilisant le rayonnement photonique, un grossissement de plus de 1500 fois donne une image trouble : Quelle que soit la qualité des lentilles, la résolution dun microscope est limitée.

16 Rayon directs Rayon réfractés La « quantité dinformation » est donc dautant plus importante que des spectres de diffraction dordres supérieurs peuvent participer à la formation de limage. Les spectres secondaires sont répartis dans lespace ; le fait de capter un plus grand nombre de rayons doit donc donner une meilleure image... Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Abbe utilise une théorie à la mode : il admet que limage créée par un microscope est liée à des interférences entre les rayons non modifiés par lobjet, et les rayons diffractés par lobjet.

17 Et ça marche...

18 Le nombre de spectres secondaires récupérés par un objectif dépend de son : ouverture numérique n car cela permet de modéliser les performances des objectifs à immersion… Louverture numérique est le sinus de l angle que fait le dernier rayon qui pénètre dans lobjectif avec laxe de celui-ci, multiplié par l indice de réfraction du milieu traversé par les rayons lumineux. Sinus car fonction croissante et de comprendre le prix de ces objectifs (pensez aux bords…) ou des objectifs à grande distance frontale (pourquoi ?….) !

19 Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope Dans ce modèle, la distance minimum entre deux points pour quils soient détectés peut alors être évalué Grosso modo, la résolution est limitée à la moitié de la longueur donde du rayonnement n.sin = ouverture numérique de lobjectif = longueur d'onde de la lumière incidente k = coefficient variant entre 0,5 et 1,22 (en fonction des capacités de l'œil, en particulier à distinguer les différences de luminosités, et de lorientation de la source lumineuse. En règle générale, on prend k = 0,61) Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique de 1,4 ( = 70°, huile à immersion dindice 1,15 ) : Doù d = 194 nm pour les radiations bleues (450 nm)… Cest la limite de résolution théorique du microscope optique

20 Université de Toronto (1938)

21 Porter KR, Claude A & Fullam EF (1945) J. Exp. Med. 81 :

22 RCA scope (1956) JEOL (années 1980)

23 UHV-TEM de Jeol Le petit dernier de Philips...

24 Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste Problème : transmission…. Il faut passer au travers de lobjet ! Doù lidée de le couper en tranches fines

25 - couper implique de durcir…par congélation par inclusion paraffine plastique - inclure implique de maintenir... - observer implique de contraster... par fixation chimique par coloration générale élective par histochimie par immunocytologie

26 Doù le déroulement classique : Fixation de lobjet Inclusion Coupe Coloration / contraste et enfin… Observation qui sera adapté - en fonction des contraintes des techniques microscopiques - en fonction du but recherché...

27 - fixateurs coagulants (précipitants) - fixateurs non coagulants (pontants) - fixateurs coagulants (précipitants) Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans laltérer… Formaldehyde Glutaraldehyde Tétroxyde dosmium - Méthanol, éthanol, acétone - Acide acétique, acide picrique - Composés mercurés - fixateurs coagulants (précipitants)

28 - fixateurs non coagulants (pontants) Fixation : le pari impossible Inclusion Coupe Coloration / contraste / observation Stabiliser la structure sans laltérer… Et leurs mélanges : Formol, liquide de Bouin, de Carnoy, de Zencker,... Gray (1954) dresse un liste de 700 mélanges fixateurs … et précise quelle est très incomplète ! Fixer est un art aussi difficile que la cuisine...

29 Milieu liquide qui peut se solidifier … suffisamment pour être coupé fin ! Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe Coloration / contraste / observation Enrober la structure sans la déformer… Paraffine Résines plastiques (Araldite, Epon, Métacrylates…) Problème… : ce sont des milieux hydrophobes ! Nécessité de déshydrater après fixation : alcool, acétone,... Inclure demande de la patience...

30 Fixation : le pari impossible Inclusion : réussir le melting pot Coupe : jouer avec le fil du rasoir Coloration / contraste / observation Optique : 5 à 20 µm Microtome couteau acier Trancher la structure suffisamment fin… Couper demande du doigté... Electronique : 50 à 80 nm Ultramicrotome rasoir verre / diamant

31 Les principes fondateurs 1 - Histologie = microscopie !… 2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste - couper implique dinclure - inclure implique de fixer - observer implique de contraster Les principaux types de microscopie

32 Fond clair Contraste de phase Nomarski (contraste dinterférence différentielle) Fond noir Optique

33 Microscopie à fond clair : colorations Des recettes de cuisine !!! Hémalun - Eosine Azan

34 Optique Microscopie à fond clair : colorations électives Des recettes de cuisine !!!

35 Optique Microscopie à fond clair : histochimie Des recettes de cuisine !!! Problème particulier : Comment préserver lactivité enzymatique

36 Optique Microscopie à fluorescence & al. :F-microscopies (FRAP, FLIP, FRET…) microscopies à effet tunnel,... Problème particulier : Comment préserver à la fois lantigénicité et la structure...

37 Remarques techniques… Colorants : Affinité pour les molécules chargées négativement (acides nucléiques…) : - Les colorants sont chargés positivements (« bases ») Exemple : Hématoxyline, Hémalun, - Les structures sont dites basophiles Exemple : noyau, ribosomes (donc REG…) Affinité pour les molécules chargées positivement : - Les colorants sont chargés négativement (« acide ») Exemple : éosine - Les structures sont dites acidophiles Exemple : cytoplasme

38 Remarques techniques… Artéfacts… : Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation REMARQUE : tout espace non coloré… … nest pas forcément un artéfact !

39 Remarques techniques… Artéfacts… : Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation Stries / plis : - lié à la coupe / étalement

40 Remarques techniques… Artéfacts… : Rétraction : - espaces non colorés - lié à la fixation / déshydratation Stries / plis : - lié à la coupe / étalement Crapoteries variées et diverses… : - lié à la poussière ambiante, aux colorants, ….

41 Electronique : transmission Coupes Ultrafines (50 à 80 nm = 10 fois la membrane plasmique…) Contraste : Sels de métaux lourds (Acétate duranyl, citrate de plomb)

42 Electronique : transmission

43 Apparté : Tomographie...

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50 Electronique : transmission

51 Electronique : balayage ou… le retour de la REFLECTION

52 Electronique : balayage

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