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TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE ED n°2, DCEM1 Purpan, 2011-2012.

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1 TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE ED n°2, DCEM1 Purpan,

2 Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie Immunohistochimie Biologie moléculaire Cytométrie en flux Télépathologie

3 Immunohistochimie Techniques – Matériel coupes en paraffine ou coupes en congélation – Mode de visualisation Immunofluorescence (UV) Immunoenzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline- lumière blanche) Interprétation – batterie danticorps – témoins intrinsèques, réactivité croisée

4 Immunohistochimie 1 = Antigène 2 = Anticorps primaire 3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine- biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase

5 Immunohistochimie Applications – pathologie hémolymphatique – Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels – classification des lymphomes – pathologie tumorale – identification des tumeurs malignes indifférenciées – substance spécifique de certaines tumeurs – expression des R hormonaux – évaluation de la croissance tumorale – recherche cibles thérapeutiques – pathologie non tumorale – pathologie rénale : glomérulopathies – pathologie cutanée bulleuse – pathologie inflammatoire (ex: agent pathogène)

6 Immunohistochimie Applications – pathologie hémolymphatique – Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels – classification des lymphomes – pathologie tumorale – identification des tumeurs malignes indifférenciées – substance spécifique de certaines tumeurs – expression des R hormonaux – évaluation de la croissance tumorale – recherche cibles thérapeutiques – pathologie non tumorale – pathologie rénale : glomérulopathies – pathologie cutanée bulleuse – pathologie inflammatoire

7 Ag HbS

8 Immunohistochimie Applications – pathologie hémolymphatique – Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels – classification des lymphomes – pathologie tumorale – identification des tumeurs malignes indifférenciées – substance spécifique de certaines tumeurs – expression des R hormonaux – évaluation de la croissance tumorale – recherche cibles thérapeutiques – pathologie non tumorale – pathologie rénale : glomérulopathies – pathologie cutanée bulleuse – pathologie inflammatoire

9 Immunohistochimie Exemple utilisation des anticorps monoclonaux dans le diagnostic des tumeurs malignes sur coupes en paraffine TumeursKL1Anti-LCA (CD45) Anti- PS100 HMB45 Carcinome+--- Lymphome-+-- Sarcome--+/-- Mélanome--++

10 Immunohistochimie applications

11 Ganglion médiastinal HE

12

13 Ganglion médiastinal IHC anti-CD45

14 Ganglion médiastinal IHC KL1

15 KL1+ Anti-CD45- Métastase ganglionnaire dun carcinome

16 Tumeur cutanée indifférenciée

17 Tumeur cutanée indifférenciée: IHC KL1

18 Tumeur cutanée indifférenciée:IHC HMB45

19 Tumeur cutanée indifférenciée: IHC anti-protéine S100

20 KL1- HBM45+ Anti-PS100+ Mélanome

21 Immunohistochimie Applications – pathologie hémolymphatique – Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels – classification des lymphomes – pathologie tumorale – identification des tumeurs malignes indifférenciées – substance spécifique de certaines tumeurs – expression des R hormonaux – évaluation de la croissance tumorale – recherche cibles thérapeutiques – pathologie non tumorale – pathologie rénale : glomérulopathies – pathologie cutanée bulleuse – pathologie inflammatoire

22 Ganglion cervical métastatique, HE

23 Ganglion cervical métastatique: IHC anti-thyroglobuline Métastase dun adénocarcinome thyroïdien

24 Immunohistochimie Applications – pathologie hémolymphatique – Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels – classification des lymphomes – pathologie tumorale – identification des tumeurs malignes indifférenciées – substance spécifique de certaines tumeurs – expression des R hormonaux – évaluation de la croissance tumorale – recherche micrométastases – pathologie non tumorale – pathologie rénale : glomérulopathies – pathologie cutanée bulleuse – pathologie inflammatoire

25 Mélanome et ganglion sentinelle: recherche de micrométastase par immunohistochimie avec HMB45, non décelable sur H&E Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire

26 Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie Immunohistochimie Biologie moléculaire hybridation in situ PCR Cytométrie en flux Télépathologie

27 Biologie moléculaire Hybridation in situ – Techniques Coupes en paraffine ou coupes en congélation Sondes froides (= non radio-actives) Chromogéniques (CISH) Fluorescentes (FISH) – Applications Détection du génome de certains virus Détection de translocations chromosomiques, damplification génique

28 HPV

29 Détection par FISH dune fusion entre les chromosomes 17 et 22 dans une lésion cutanée Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand

30 Détection par FISH dune amplification du gène HER2 dans un carcinome mammaire Utilité thérapeutique Prescription dun inhibiteur de Erb-2 Non amplifié Amplifié DuoCISH, Dako HER2 / Cen17 DuoCISH, Dako HER2 / Cen17

31 Biologie moléculaire PCR (Polymerase Chain Reaction) – Rappel de son principe – Technique – Applications

32 1/ Principe de la PCR 3 étapes: - dénaturation thermique: 94°C, 30s à 1 mn - hybridation des amorces (annealing): 40 à 70°C,1 min - élongation: 72°C, durée variable selon le fragment à amplifier Dénaturation + Hybridation + Elongation = 1 cycle au cours duquel quantité ADN cible x 2. Au bout de n cycles: 2 n molécules ADN cible.

33 2/ Principales étapes de la technique

34 Anomalies géniques -Mutation -Translocations chromosomiques 3/ Applications en anatomie pathologique Mise en évidence de la clonalité lymphoide

35 Mutation Ex: mutation du gène BRAF dans le mélanome métastatique Intéret thérapeutique (prescription dun inhibiteur de BRAF) Séquençage du produit PCR correspondant à lamplification de la zone du gène où se situe la mutation

36 Translocation chromosomique Détection par PCR à laide de deux amorces encadrant la zone réarrangée CHR 2CHR 5 Amorce A Amorce B Gène AGène B Intérêt diagnostique (translocation spécifique de tumeur) Intérêt pronostique (ex: recherche de la maladie résiduelle après traitement dun lymphome porteur de cette translocation)

37 Polyclonalité et monoclonalité lymphoide Prolifération polyclonale bénigne Comment établir le caractère clonal ou polyclonal ? Identité ou non-identité du récepteur à lAg qui caractérise un lymphocyte donné Prolifération monoclonale maligne Ig pour lymphocyte B TCR pour lymphocyte T Intérêt diagnostique

38 Polyclonal VDJ VDJ Monoclonal Etablissement de clonalité par PCR

39 Contraintes a- ADN de bonne qualité * délai de congélation * qualité et temps de fixation (Formol) b- Contaminations - lors des coupes (changer de lames, de gants entre chaque cas, nettoyer le support de lames) - lors de toutes les phases dextraction dADN, damplification et délectrophorèse. c- Contrôles : Témoin négatif (eau) Témoin positif

40

41 Les immunoglobulines (Ig): récepteurs à lantigène des lymphocytes B Partie variable des Ig: carte didentité dun lymphocyte B

42 La diversité combinatoire

43 La diversité jonctionnelle V N J C2 Zone jonctionnelle N D 1/ Délétion de nucléotides en aval de V, en amont de J ou de part et dautre de D 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT)

44

45 PCR 1- BREF RAPPEL double hélice ADN –2 brins antiparallèles –enchaînement de bases reliées entre elles par des liaisons hydrogènes faibles et thermolabiles : A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G molécule double brin 2 molécules simple brin dénaturation thermique

46 Maladies infectieuses : Virus (HPV : non cultivable,CMV: rejet de greffe rénale, VIH...), bactéries (à croissance lente : mycobactéries)… Anomalies géniques - Mutation - Translocation chromosomique détection de la t(14;18) par PCR: amplification de la zone jonctionnelle, variable dun clone à lautre. t(2 ;5) et lymphomes anaplasiques à grandes cellules - Etablissement de la clonalité lymphoïde Applications CHR 2CHR 5 amorce


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