Long-term Engraftment of Single Genetically Modified Human Epidermal Holoclones Enables Safety Pre-assessment of Cutaneous Gene Therapy F Larcher, E Dellambra,

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1 Long-term Engraftment of Single Genetically Modified Human Epidermal Holoclones Enables Safety Pre-assessment of Cutaneous Gene Therapy F Larcher, E Dellambra, L Rico, S Bondanza, R Murillas, C Cattoglio, F Mavilio, JL Jorcano, G Zambruno, M Del Rio

2 Avant - propos Le DICS-X ou X-SCID Le DICS (Déficit Immunitaire Combiné Sévère) est un groupe de troubles génétiques rares caractérisé par des anomalies profondes de l'évolution et de la fonction des LT, LB et des cellules NK. La forme la plus courante est le DICS lié à l'X (environ 50 % des cas). Par son attachement au chromosome X, le DICS-X n'affecte que les garçons. Il se caractérise par 1 anomalie du gène codant la chaîne gamma courante (γc) commune aux récepteurs de plusieurs interleukines (IL2, 4, 7, 9, 15), conduisant à une absence totale de LT et de cellules NK. Il touche en moyenne un bébé sur 200.000 à la naissance (5 nvx-nés/an en France).

3 Possibilités thérapeutiques Greffe de moelle osseuse Thérapie génique avec utilisation d’un vecteur (Thérapie génique avec utilisation de méga nucléase ?)

4 Rappels historiques 1990  premier essai de thérapie génique sur une fillette ADA-SCID mené par WF Anderson et RM Blaese avec un vecteur rétroviral 1999  Vecteur rétroviral pour pallier la déficience du gène IL2RG (récepteur) responsable du X-SCID équipe du Pr Alain Fischer, hôpital Necker (INSERM U768).

5 Rappels historiques 2002  suspension des essais thérapeutiques : cas de leucémie chez deux enfants traités par thérapie génique 2003  début d’explication insertion à proximité d’un proto-oncogène LMO2 + les 2 enfants étaient les plus jeunes et avaient reçues plus de cellules

6 Problématique Volonté de pré-évaluer un isolat de cellules souches (CS) modifiées génétiquement et de leur progéniture. Pas possible pour l’instant techniquement sur CS hématopoïétiques donc tentées avec CS épidermiques But: Génerer une peau humaine à partir de CS isolées, modifiées et pré-évaluées.

7 Les CS épidermiques Les CS épidermiques sont retrouvées sous la forme de kératinocytes (90% des cellules de l’épiderme) 3 types de CSE en fonction de leur possibilité à former des colonies: Holoclones (potentiel le plus élevé) Méroclones Paraclones (potentiel le plus faible)

8 Résultats: Isolation des holoclones et procédure de greffe

9 Résultats: détermination des holoclones

10 Apparence Macroscopique de l’architecture de l’épiderme

11 Résultats: Histologie En m, expression de p63 marqueur d’une grande capacité proliférative

12 Résultats: Stabilité et intégration chromosomique

13 Résultats : Sites d’intégration proviraux

14 Conclusion Nécessité technique rigoureuse de greffe et culture organotypique Intérêt de développer et tester les cellules modifiées avant transplantation Technique peu compatible avec le tissu hématopoïétique Risques non négligeables de mutagénèse

15 Clinique Intérêt de cette expérience chez les enfants atteints de Xeroderma Pigmentosum mais aussi chez des patients atteints de diverses génodermatoses.

16 Alternative thérapeutique Une méganucléase est une protéine qui coupe l'ADN à un endroit très précis sur un chromosome. Une fois que l'ADN est coupé, il doit être réparé par les systèmes endogènes naturels de maintenance de la cellule. En fournissant une molécule d'ADN fabriquée spécifiquement (appelée matrice de réparation) qui sera utilisée comme matrice nucléique pour réparer la cassure, on peut diriger le mécanisme de réparation vers un processus d'insertion, de suppression ou de correction.

17 Merci de votre attention