6-La Métagénomique 6.1-Principe

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1 6-La Métagénomique 6.1-Principe
Echantillon prélevé à partir d’un environnement complexe Filtration Lyse et extraction d’ADN Clonage et construction de banques  la métagénomique — consiste à étudier collectivement les gènes, sans les détailler individu par individu. L'avantage est une rapidité plus grande de l'analyse et le principe présente également une pertinence d'un point de vue écologique. L'information importante est en effet de savoir quels gènes, donc quelles fonctions biologiques, existent dans le milieu. A partir d’un échantillon complexe de l’environnement, l’ADN génomique total est extrait, des fragments sont insérés dans des BAC (Bacterial Artificial Chromosome) puis transformés dans E. coli. Il s’agit ici d’une grande innovation technologique qui permet de contourner l’étape de PCR. En effet, les méthodes génomiques basées sur la PCR sous estiment le nombre total de génotypes et permettent l’accès à un tout petit nombre de nucléotides. Des banques de clones sont ainsi construites. Les clones sont séquencer (pyroséquencage) avec la technique du shotgun. (en vrac ou aléatoire global) C’est une technique de séquencage par petits bouts. Le fragment à séquencer est fractionné en sous-fragments puis un très grand nombre de séquençage est effectué (10 fois supérieur à la taille du fragment à séquencer). Ce séquencage à haut débit est couplé à une analyse bio-informatique qui permet de comparer toutes les séquences obtenues. Par comparaison les parties qui se recouvrent ou qui sont chevauchantes seront alignées. Puis assemblées en enchaînements plus grands que l’on appelle contigs. Puis en scaffold (assemblages des contigs) Elle permet ainsi en collant des contigs à d'autres contigs de reconstituer des séquences de plusieurs millions à plusieurs dizaines de millions de bases. Séquençage des clones Assemblages des séquences en contigs et scaffold

2 Explorer une myriade d’environnements Exotiques ou familiers: Océans
6-La Métagénomique 6.2: Intérêt Explorer une myriade d’environnements Exotiques ou familiers: Océans Cheminées hydrothermales ; Bassin minier acide; permafrost, Désert; Tube digestif des ruminants, des humains…. Conséquences: Evaluer la biodiversité, comprendre les relations symbiotiques, découvrir des nouveaux enzymes, antibiotiques Le fait de s’affranchir de l’étape culture et de l’étape PCR ouvre des horizons presque illimités. La richesse potentielle de ressources biologiques dans la nature (comme des microbes) est relativement inexploitée, inconnue et non caractérisée. La métagénomique représente un outil puissant pour avoir accès à la biodiversité abondante d'échantillons environnementaux natals. Beaucoup de microorganismes ont la capacité de dégrader des déchets, faire de nouveaux médicaments, faire des plastiques respectueux de l'environnement, ou faire même certains des ingrédients de nourriture que nous mangeons. En isolant l'ADN de ces organismes, il nous fournit l'occasion d'optimiser ces processus et les adapter à l'utilisation dans notre société. Limitations: Les données de séquence sont obtenues à partir d’un million d’individus présents dans un échantillon biologique, cependant il n’est généralement pas possible d’assembler des génomes entier correspondant à un seul individu, sauf peut etre pour les individus qui sont très abondants dans une communauté donnée. Cependant même les quelques génomes entiers obtenus à partir d’individus multiples sont différents du génome obtenu à partir d’un seul microrganisme isolé. Il est possible maintenant de faire du séquençage à partir d’une seule cellule! Pour obtenir suffisament d’AND matrice, il est nécessaire d’amplifier les toutes petites quantités d’AND génomiques d’un indidividu donné isolé à partir d’un échantillon. Cela se fait par des nouvelles techniques de PCR.

3 6.3: La métagénomique des Océans
Global Ocean Sampling (GOS) Expedition (J. Craig Venter) 41 surface water samples collected from the North Atlantic to the South Pacific Oceans yielded 7.7 million new sequence reads encoding 6.12 million genes, including many new genes of ecological importance. Par exemple, en 2004, une seule étude de métagénomique (the Global Ocean Sampling study-échantillon de tous les océans ), les gènes codant pour 6 million de nouvelles protéines ont été séquencés ce qui équivaut presque au nombre de protéines totales qui étaient déjà connues!!! Pourquoi une si haute diversité microbienne dans les océans ? est elle due au fait que dans un millilitre d’eau de mer on va trouver outre des microrganismes mais aussi des centaines de millions de particules virales et de particules de bactériophages favorisant les transferts horinzontaux de gènes???

4 Ley, Peterson, Gordon. Cell 2006 ;124:837
6-La Métagénomique 6.4-La métagénomique de notre corps 6.4.4-Les microbes et nous 1014 microbes!!! Essentiellement dans l’intestin Colonisation de l’intestin en 4 phases: Phase 1: l’intestin Phase 2: Acquisition initiale lors de l’accouchement par le vagin, les selles et la peau Phase 3: Allaitement Le lait maternel: Bifidobacterium (plus de 90% de la flore) Lait industriel: plus de Bacteroides et de Clostridium Phase 4: Les selles commençent à devenir dures = flore adulte 1014) (un milliard de milliard) de microbes 90% des cellules de notre corps sont des microbes! Un organe additionel??? La majeure partie de ces bactéries vivent dans nos intestins. 100 fois plus de gènes dans notre intestin quand dans nos cellules! On peut donc considérer que notre flore intestinale est une partie intégrante de notre propre évolution à l’échelle de notre vie et à l’échelle de l’évolution de l’homme Naissance par voie naturelle ou par césarienne modifie les phases précoces de la colonization de l’intestin et peut etre sa composition à long terme? Phase 3/4: Le tube digestif du nouveau né est un environnement très oxidatif et les premiers colonisateurs seront des bactéries anaérobies facultatives comme les proteobacteries qui vont diminuer la concentration en oxygène pour permetttre la colonisation par les genres anaérobies: Bacteroides, actinobacteria and firmicutes. Durant les premières années la composition est simple et varie grandement d’un individu à l’autre et à travers le temps. La signature microbienne ressemble à celle d’un adulte lorsque celui-ci atteint 1/2 ans. Ley, Peterson, Gordon. Cell 2006 ;124:837 Ley, et al. PNAS. 2005, 102: 11070 Edwards, et al. Br J Nutr. 2002

5 6.4-La métagénomique de notre corps 6.4.4-Les microbes et nous
« Human Microbiome Project » et «  METAgenomics of the Human Intestinal Tract » . Lancé par le NIH (national institute of health): le pendant américain en octobre 2007 The human microbiome project: Séquençage métagénomique des communautés microbiennes de 15 à 18 sites du corps colléctés à partir de 250 individus sains et obèses Dans Nature mars 2010: Contrairement au génome humain, intégralement séquencé, le contenu génomique des communautés bactériennes de notre tube digestif était jusqu’à ce jour largement inconnu. Vivant sans oxygène, à l'abri de nos intestins, dans un environnement difficile à caractériser et à reproduire, la plupart des bactéries ne peuvent pas être cultivées en laboratoire. Pour pallier cette difficulté, un consortium international, auquel participe le Génoscope d'Evry, a analysé le génome des bactéries présentes dans les selles de 124 personnes, européennes. 124 individus sains, en surcharge pondérale, obèses et ayant une inflammation intestinale chronique Ce programme, baptisé MetaHIT (METAgenomics of the Human Intestinal Tract)), a été lancé en L'INRA ? Logique, car c'est cet institut qui a coordonné la recherche de 12 organismes européens de recherche et d'industriels (Danone, Mérieux) et  de l'Institut de génomique de Pékin à Shenzen, avec un financement européen de 11,4 millions d'euros, la moitié du coût total.

6 DiBiase, et al. Mayo Clin Proc 2008;83:460-469
L’identité de nos habitants: 99.1% des microorganismes sont d’origine bactérienne, le reste étant des archées. On trouve des firmicutes (Gram +/ motile), des bacteroides (bacilles gram-), beaucoup d’anaérobies (1000 anaérobies pour une aérobie), beaucoup moins de diversité d’espèces que dans l’environnement (500 à 1000 fois moins). Variations de cette flore pour chaque individu. Très complexes de comprendre le pourquoi du comment. chez les personnes obèses ou atteintes de maladies inflammatoires intestinales et les sujets sains, montrent que des déséquilibres de la flore digestive peuvent contribuer au développement de maladies. DiBiase, et al. Mayo Clin Proc 2008;83:

7 Goldin BR in Gastrointestinal Microbiology 138-154, 2006
Les réactions métaboliques réalisées par la flore intestinale microbienne: Metabolic reactions Ces millions de bactéries sont vitales : elles synthétisent des vitamines, contribuent à la dégradation de molécules que nous serions incapables d'assimiler directement, jouent un grand rôle dans les fonctions immunitaires en nous protégeant contre les bactéries pathogènes. Les enzymes humaines ne peuvent pas dégrader la plupart des polysaccharides des légumes et des fruits. C’est dans la partie distale de notre intestion que l’on trouve les enzymes microbiennes qui vont pouvoir dégrader ce type de susbstrat. L’embranchement Bacteroide est largement adapté pour dégrader les glycanes (polysaccharides) de son hôte. Cette adaptation est illustrée par des enzymes capables de dégrader l’amidon, la pectine, les hemicelluloses ainsi que des polysaccharides de l’hôte. Dans les études métagénomiques réalisées sur l’intestin, on trouve donc un grand nombre de gènes qui codent pour des enzymes qui dégradent les polysaccharides. Variations liées au régime alimentaire: Par exemple le microbiome du TD des nords américains est adapté à digérer des régimes riche en graisse et en protéine alors que les amazonien du venezuela et les population rurale du malawi ont une flore adapté pour rompre sucres complexes. La flore s’adapte au régime alimentaire de son hôte. Par conséquent l’évolution de la machinerie capable de dégrader les polysaccharides est la clé du mutualisme entre l’hôte et les bactéries. Au regard de cette communauté microbienne spécialisée dans la dégradation des polysaccharides, on peut se demander comment les membres de cette communauté ont évolués et comment ils évoluent face à de nouvelles sources de polysaccharide. Voici un exemple de transfer horizontal intéressant… Goldin BR in Gastrointestinal Microbiology , 2006

8 6.4.6-Un transfert horizontal entre un sushi et un japonais!!!
6-La Métagénomique 6.4.6-Un transfert horizontal entre un sushi et un japonais!!! Mirjam Czjzek – CNRS Two species of Porphyra (P. leucosticta – the larges, brown leaf; P. linearis – smaller, reddish fragments), collected at low tide from beaches near to Roscoff in Brittany. Transfer d’une enzyme de bactérie marine qui dégrade des polysaccharides au microbiome d’un intestin de japonais nature avril 2010 Le groupe de Hehemann (IFEMER, Roscoff, institut Pierre et Marie Curie) est spécialisé dans l’étude d’une bactérie marine membre des Bacteroidetes: Zobellia galactanivorans. Ils ont identifié et caractérisé une nouvelle classe de glycoside hydrolase. Cette enzyme est capable de cliver un polysaccharide appelé porphyran qui est très abondant dans la paroi des algues rouges de l’espèce Porphyra. Les japonais utilisent cette algue depuis plusieurs siècles pour payer des taxes, faire des cadeaux ou pour préparer des sushis. Les auteurs ont résolu la structure de cet enzyme lié à son substrat, le porphyran et ont ainsi pu identifié les régions de l’enzyme qui permettent sa spécificité vis à vis de ce substrat, la signature. L’analyse de métagenomes provenant des selles de 13 japonais et 18 nord américains a révélé que le gène codant pour cet enzyme est aussi présent dans le génome d’une bactérie résidente de l’intestin, Bacteroides plebeius. Aucun autre membre des espèces bacteroides des intestins contient ce gène. Ce qui suggère que B. plebeius acquis ce gène de manière latérale (ainsi que d’autres gènes adjacents marins dégradant les polysaccharides) à partir d’une bactérie la marine. La question est alors pourquoi une bactérie qui vie dans l’intestin humain aurait besoin de gènes codant pour des enzymes capables de dégrader un polysaccharide d’algue? L’équipe remarque que les six souches de B. plebeius qui contiennent les séquences de porphyranase ont été isolées à partir des selles des japonais. L’analyse révèle que ces séquences sont présentes en grandes quantités dans les selles de japonais mais pas dans les selles des nord américains. Les auteurs ont donc conclu que l’algue qui est largement répandu dans les habitudes alimentaires des japonais notamment pour entourer les sushis était probablement la source du microorganisme qui a apporté le gène d’intérêt. Bien qu’on ne comprenne pas quand le transfer a été ralisé la consommation continuelle d’algues est vraisemblablement la raison pour laquelle ce gène a été retenu par le microbiome des japonais. Il reste donc à déterminer comment, durant l’évolution de l’homme, les changements d’ahabitude alimentaires (source et préparation) ont façonné la flore de notre intestin. Les bactéries associées à l’homme ont un taux de transfert horizontal 25 fois supérieur aux bactéries de l’environnement ce qui illustre le rôle primordiale du transfert horizontal de gène entre un hôte et la communauté de bactéries associée Ainsi la consommation dans des conditions d’hygiène strictes, l’industrie alimentaire, la nourriture haute en calorie peut rapidemment modifier le microbiome des individus vivants en pays industrialisés et priver le microbiome d’un réservoir de gènes environnementaux enssentiel pour les transfers latéraux. D’un autre côté, la démocratisation des voyages, l’accès à des nouveaux types de nouritures sont peut etre des sources de nouveaux microbes et nouveaux gènes pour notre microbiome. La prochaine fois que vous allez gôuter quelque chose de nouveau, pensez aussi aux nouvelles bactéries que vous allez ingérer et la possibilité que vous offrez à vos milliards de milliards de bactéries de jouer avec un nouveau set d’ustensiles. Tristan Barbeyron – CNRS Colonies of the marine flavobacteria Zobellia galactanivorans, applied to agar medium in a Petri dish.

9 7-Conclusion La longue histoire en passant par des ancêtres communs, des habitats communs entre les animaux et les microbes se reflète dans nos gènes. La vaste analyse des génomes révèle que la plupart des formes de vie partagent environ un tiers de leur gènes. Plusieurs gènes d’animaux sont donc homologues à des gènes bactériens par héritage et à l’occasion par transfert horizontal. Par exemple, 37% des gènes humains ont des homologues chez les bactéries et les archées, 28% d’eucaryotes unicellulaires. A ce répartoire s’ajoute donc les milliards de milliards de bactéries qui vont étendre notre répertoire métabolique.

10 Les questions que vous pourriez avoir à l’évaluation:
-Quels sont les différents domaines du vivant? -Pourquoi les critères morphologiques, biochimiques et physiologiques ne permettent pas d’obtenir une classification des espèces satisfaisante? -Qu’est ce qu’une classification phylogénétique? -Les archées sont-elles nos ancêtres? -Qu’est ce qui caractérise les embranchements Thermotoga et Aquifex? -Qu’est ce qui caractérise l’embranchement Planctomyces? -Qu’est ce qui caractérise l’embranchement Cyanobactérie? -Dans quel embranchement et classe est classé Escherichia coli? -Que signifie Gram+? -Qu’est ce qu’un transfert de gène horizontal? -Une bactérie peut elle acquérir une résistance à un antibiotique par mutation génétique? -Expliquer ce qu’est la transduction? -A-t-on identifié toutes les espèces bactériennes existantes? Pourquoi? -Qu’est ce que la métagénomique? -Donnez un exemple de transfert latéral bénéfique pour son hôte -Quelle est la composition de la flore intestinale humaine? -La flore intestinale est elle bénéfique pour l’homme? -Qu’est ce qu’un gène homologue? -Qu’est ce qu’un microorganisme photohétérotrophe? -Tous les individus ont-ils la même flore intestinale? -Citez les chronomètres moléculaires que vous connaissez.