Biologie moléculaire - jour 2

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1 Biologie moléculaire - jour 2

2 Commentaires J1 - gels d'agarose
bien rincer l'Erlenmeyer avec +++ d'eau chaude IMMÉDIATEMENT !!! sinon, l'agarose restant fige = problèmes de lavage

3 Commentaires J1 - produits
biomol = réactifs toujours sur glace (sinon = "Deadzyme") produits en dehors du -20C le moins possible (6X LB à 4oC) « quick spin » avant d'ouvrir un tube bien lire les notes de cours % d'agarose utiliser le P20 pour charger les gels (P10)

4 Commentaires J1 - prep des échantillons
facile de faire un erreur/oubli

5 Commentaires J1 - prep des échantillons
facile de faire un erreur/oubli

6 Commentaires J1 - prep des échantillons
facile de faire un erreur/oubli

7 Commentaires J1 - efficacité
organisation/efficacité/planification s'assurer que le gel soit prêt quand les digestions terminent s'assurer que le marquer est déjà préparé quand les digestions terminent compte rendu/ménage/cahier durant la migration

8 Biologie moléculaire- organigramme
digestion des plasmides + gels d'agarose (compte rendu) PCR Purification d’ADN de 2 plasmides à partir de cultures bactériennes Extraction et purification d’ARN de foie de lapin Polymérisation en cascade (PCR) Coupure des ADN par les enzymes de restriction Analyse sur gel d’agarose (0,8%) et compte rendu Analyse sur gel d’agarose (2%) et compte rendu Analyse sur gels d’agarose (1%) Analyse sur gel d’agarose (1%) et compte rendu Préparation des cartes de restriction et compte rendu

9 Plasmides molécules d'ADN extrachromosomiques ADN double brin + circulaire répliquent de façon autonome encodent résistance à un antibiotique vecteurs de choix dans biologie moléculaire

10 Enzymes de restriction
clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt) nommer pour l’organisme duquel c’était isolé (e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli) digestion produit 3 sortes de bouts

11 Enzymes de restriction
site de coupure (4-8 nt) site de coupure = palindrome 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5’ ’ 3’ ’ Extension 5’

12 Enzymes de restriction
site de coupure (4-8 nt) site de coupure = palindrome 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 5’ ’ Extension 3’ 3’ ’

13 Enzymes de restriction
site de coupure (4-8 nt) 5’ ’ 3’ ’ Bouts francs

14 Enzymes de restriction
clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt) nommer pour l’organisme duquel c’était isolé (e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli) digestion produit 3 sortes de bouts 1. extension 5’ 2. extension 3’ 3. bouts francs Bouts cohésifs

15 Enzymes de restriction - exemples
BamHI 5'-G/GATCC-3' 3'-CCTAG/G-5' KpnI 5'-GGTAC/C-3' 3'-C/CATGG-5' convention biomol toujours 5'  3'

16 Enzymes de restriction - exemples
BamHI 5'-G/GATCC-3' 5'-G 3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG-5' KpnI 5'-GGTAC/C-3' 5'-GGTAC-3' 3'-C/CATGG-5' 3'-C extension 5’ bouts cohésifs extension 3’

17 Enzymes de restriction - bouts cohesifs
BamHI 5'-G/GATCC-3' 5'-G 3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG GATCC G

18 Enzymes de restriction

19 Analyse des digestions
gel d'agarose (attention: % d'agarose)

20 Analyse des digestions
gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel)

21 Analyse des digestions
gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel) M Taille (pb) 10000 8000 6500 4000 1500 1000 ligne des puits

22 Graphique - log taille vs distance
pas linéaire pas de courbe de tendance (droite) taille (pb) - échelle logarithmique distance (cm)

23 Graphique - papier semi-log
graphique de taille vs distance sur papier semi-log bandes de 250 à 10000pb (1 kpb ladder) 10000 taille (pb) 1000 100 distance (cm)

24 Graphique - papier semi-log
100 1000 10000 taille (pb) distance (cm) 580pb

25 Analyse des digestions
gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel) résultats utilisés pour établir la carte de restriction du plasmide

26 Carte de restriction enzyme qui coupe 1 fois est utilisée pour estimer la taille du plasmide

27 2 sites Carte de restriction
enzyme qui coupe un plasmide de 4,5 kpb deux fois séparées de 1,5 kpb (1000 pb = 1 kpb) 2 b a n d e s 2 sites

28 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 Maintenant, sur le site web j’avais mis un exercice pour vous faire pratiquer comment deviner la carte de restriction d’un plasmide. J’espère que vous l’avez essayer!!! J’aimerai le faire ensemble maintenant pour vous montre comment proceder.

29 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 Ier étape: nombre de site(s) par enzyme 2 1 Faire le point sur le fait que le plasmide est circulaire, alors un fragment=1 coupure, 2 fragments=2 coupures, etc. N’oublier pas que le plasmide est circulaire!

30 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 2ième étape: taille Indiquer que la première étape, si possible, est de trouver une enzyme qui coupe seulement un fois. Comme ça on peut déterminer la taille du plasmide qui est un information EXTREMEMENT utile. Portez attention car souvent ça surestime la taille. Vaut mieux faire la somme de fragments dans la zone précise du gel. 15 kpb (±)

31 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 3ième étape: placer EcoRI EcoRI 5 10 Maintenant essayer de placer les sites d’une enzyme. Évidemment il est plus facile de placer les enzymes qui n’ont pas trop de sites, alors commencer avec celles qui donnent le moindre de bandes sur le gel.

32 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 4ième étape: placer SalI SalI 2 3 SalI EcoRI EcoRI 5 En vue qu’il y a seulement 1 site il faut que le SalI coupe un des deux fragment d’EcoRI. Noter que les nouvelles tailles sont indiquées. 10

33 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 5ième étape: placer les BamHI SalI 2 1 BamHI 2 EcoRI 3 EcoRI BamHI Essentiellement on essaye de placer les autres enzymes en fonction de ce qu’on a fait, et on regarde pour voir si ça donne les bandes obtenues. Sinon, on recommence. 10

34 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 5ième étape: placer les BamHI SalI BamHI 2 EcoRI 1 EcoRI 2 6kpb Encore notez que les tailles étaient ajustées. 7 BamHI 3 10

35 Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites BamHI kpb EcoRI SalI BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp BamHI / SalI 9, 5, 1 EcoRI / SalI 10, 3, 2 6ième étape: vérification SalI BamHI 2 EcoRI 1 EcoRI 2 3 (15 kpb) BamHI 7

36 PCR conçu en 1983 par Kary Mullis (prix Nobel en 1993) changé le cours de la biologie moléculaire

37 PCR produit, in vitro, des nombres gigantesques de copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un mélange d'ADN basé sur le fonctionnement cyclique d'un ADN polymérase

38 ADN polymérases synthèse de l’ADN en ajoutant des nucléotides au bout 3'-OH d’un l'amorce hybridé à un brin d’ADN matrice direction de synthèse est 5'→3'. précurseur est un dNTP qui perd les deux phosphates en position terminale

39 ADN polymérases matrice amorce

40 ADN polymérases matrice amorce

41 PCR - étapes du cycle

42 PCR - étapes du cycle N.B. La polymérase doit être thermostable.

43 PCR - étapes du cycle Amorce 5' Amorce 3'

44 PCR - étapes du cycle Amorce 5' Amorce 3'

45 PCR - une amplification
nombre de copies = 2n (n = # de cycles)

46 PCR - une amplification
nombre de copies = 2n (n = # de cycles) Copies produites Énorme!

47 PCR song

48 Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs
1 boîte/table à -20oC gardez sur glace en tout temps retournez les tubes à -20oC après l'utilisation (ne jeter pas les restants!) « quick spin » avant d'ouvrir un tube

49 Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs
1 boîte/table pour vos échantillons d'ADN (bien les identifier, ne pas jeter vos PCRs) pas de réaction de PCR = perte de points HindIII vs λH3

50 Point technique - volumes en biomol
biologie moléculaire = petits volumes (~10 μL) soyez prudent dans vos pipettages (P10) toujours sur glace vérifier le volume aspiré rentrer l'embout dans le liquide avant la livraison surveiller la livraison il faut mettre les tubes de 200 et de 500 μl dans des tubes de 1,5 ml pour les centrifuger

51 Points techniques - digestions
utilisez 6/12 μl d'ADN / digestion - 6 μl pour les digestions simples - 12 μl pour les digestions doubles

52 Points techniques - digestions
Digestions simples: 10 μl volume final 1 μl enzyme* Digestions doubles: 20 μl volume final 1 μl de chaque enzyme* (i.e. 2 μl total d'enzyme) *Seulement 10% du volume final peut être enzyme. Pourquoi? Garder les enzymes en dehors du congélateur le minimum possible (quick spin avant d'ouvrir).

53 Points techniques - gel d'agarose
utilisez le peigne avec 8 (Pharmacia) ou 10 dents (Labnet) préparer deux gels (1%) de 60 ml (Pharmacia) ou 100 ml (Labnet) / équipe Gel #1: digestions de plasmide A Gel #2: digestions de plasmide B

54 Points techniques - gel d'agarose
chargez 12 μl digestions simples 15 μl digestions doubles (pas les 24 μl) N'OUBLIEZ PAS DE METTRE LE STANDARD (1KB LADDER) SUR LES DEUX GELS!!!!

55 Points techniques - gel d'agarose
laissez figer suffisamment de temps portez attention en enlevant les blocs de caoutchouc - allez lentement enlever le peigne après les blocs de caoutchouc

56 Mise en garde... aucun site activité étoile et digestions partielles

57 Mise en garde... aucun site activité étoile et digestions partielles superposition de fragments de même taille

58 Mise en garde - superposition de bandes
Ex. plasmide d'une taille 6,4 kpb qui donne seulement des bandes de 2,9 et de 0,75 kpb 3000 2000 1000 Clairement, il y a 2 bandes ici (2,9 + 2,7 kpb). Total (kpb): 6,4 3,7 6,4

59 Mise en garde... aucun site activité étoile et digestions partielles superposition de fragments de même taille fragments de restriction trop petits pour être visibles sur le gel (surexposer lors de la photographie)

60 Mise en garde - analyse regardez la photo !! Dans le tableau
1 Dans le tableau Puits 1: 2,5; 2,2; 0,8 et 0,6 kpb 0,8

61 Points techniques - PCR
amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination embouts avec barrières (attention: choisir les bons, uniquement pour les réactions de PCR, $$$) soyez prudent de ne pas contaminer vos solutions (tampons, eau, nucléotides, etc.) diluer votre ADN plasmidique 1/20

62 Points techniques - PCR contamination
amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination plasmide +ve plasmide –ive contrôle +ve contrôle -ive non-contaminé contaminé

63 Point technique - nucleases
embouts + tubes stériles toujours portez des gants et changez-les souvent remplir les boîtes uniquement quand vide (sinon, dans tiroir) portez des gants quand vous remplissez les boîtes d’embouts boîtes remplies à l'autoclave

64 solutions préparées semaine I
Points techniques solutions préparées semaine I TAE 50X

65 Compte rendu - présentation des photos
à compléter au labo sur les images des gels faire attention de: identifier les puits indiquer les tailles des bandes du marqueur indiquer, si le marqueur est "synthétique", le fournisseur

66 utiliser pour déterminer la taille de l’ADN
Marqueurs de taille utiliser pour déterminer la taille de l’ADN préparation de l'échantillon ADN (=1 kpb ladder) 5 µl 10X OPA 2 µl H2O 3 µl 6X LB 2 µl 12 µl

67 Compte rendu - tailles des fragments
log taille vs distances de migration des bandes du marqueur papier semi-log (alors taille vs distance) à main pas de courbe de tendance un graphique pour chaque gel!

68 Biologie moléculaire - questions
ADN plasmidique superenroulé