CH.2262: Analyse instrumentale organique pour pharmacien-nes Prof. P. Belser peter.belser@unifr.ch 2014 Chimie analytique instrumentale

Le cours Littérature Vendredi: 8.15 – 10.00 h Fin: 28.05.14 Sauf: 18.04. (vendredi saint) jusque 27.04. (vacances de Pâques), L’examen écrit: TBA Moodle: Aiopp Le cours 2014 Littérature Instrumentelle Analytische Chemie Carl Cammann, Spektrum Akademischer Verlag Instrumentelle pharmazeutische Analytik Gerhard Rücker, Michael Neugebauer, Georg Willems, WVG Analytik II - Kurzlehrbuch: Quantitative und instrumentelle pharmazeutische Analytik Eberhard Ehlers, Deutscher Apotheker Verlag Taschenatlas der Analytik Georg Schwedt, Thieme Chimie analytique instrumentale

= ce que l’on cherche à déterminer Chimie Analytique L’analyse des produits  la reconnaissance  la caractérisation Quelle analyte a-t-on? – l’analyse qualitative Combien d’analyte a-t-on? – l’analyse quantitative Quelle forme d’analyte a-t-on? – l’analyse structurale Où est l’analyte? – l’analyse de distribution ou l’analyse de surface 2014 L’échantillion L’échantillion: Comprimé d’aspirine L’analyte: L’acide acétylsalicylique/0.5 g La matrice: Cellulose, fécule de maїs l’analyte = ce que l’on cherche à déterminer la matrice = tout le reste Chimie analytique instrumentale

Les domaines d’utilisation L’analyse forensique L’agriculture Les drogues 2014 L’analyse pharmaceutique Les domaines d’utilisation L’analyse des productions Chimie analytique instrumentale L’analyse de l’environnement L’alimentation L’alimentation

Les domaines d’utilisation L’analyse forensique L’agriculture Les drogues 2014 L’analyse pharmaceutique Les domaines d’utilisation L’analyse des productions Chimie analytique instrumentale L’analyse de l’environnement L’alimentation L’alimentation

Pharmacopées En Suisse: Pharmacopée européenne + pharmacopée helvétique Objet: - règlement concernant la définition, la production et le traitement, l’essai, le stockage, la déclaration, la remise et l’usage des médicaments, des substances auxiliaires et quelques produits médicaux Les monographies traitent les propriétés de/ les demandes à chaque substance. Exigences concernant la propriété, l’identité, la pureté et le taux des méthodes analytiques pour les déterminer 2014 Chimie analytique instrumentale

Souvent des méthodes instrumentales Pharmacopées En Suisse: Pharmacopée européenne + pharmacopée helvétique Objet: - règlement concernant la définition, la production et le traitement, l’essai, le stockage, la déclaration, la remise et l’usage des médicaments, des substances auxiliaires et quelques produits médicaux Les monographies traitent les propriétés de/ les demandes à chaque substance. Exigences concernant la propriété, l’identité, la pureté et le taux des méthodes analytiques pour les déterminer 2014 Chimie analytique instrumentale Souvent des méthodes instrumentales

La langue des chimistes analytiques IR RMN (NMR) AES LC CCM (DC) HPLC ESI MS UV/vis Ils aiment les abréviations! 2014 Chimie analytique instrumentale

Les méthodes spectroscopiques - introduction Histoire: 1648 Johannes Marcus Marcis explique l’arc-en-ciel avec la diffraction et la diffusion de la lumière solaire 1672 Sir Isaac Newton explique la diffraction de la lumière solaire avec le prisme 1814-1823 Frauenhofer discute les lignes noires dans le spectre solaire – absorption de la lumière? 1859 la loi du rayonnement de Kirchhoff: Liaison d’émission et absorption 2014 Chimie analytique instrumentale

Les méthodes spectroscopiques - introduction 1885 Balmer trouve une formule empirique donnant les longueurs d'onde pour le spectre de H2 1900 Plank postule la quantification de l’énergie 1913 Modèle de Bohr 2014 Chimie analytique instrumentale

La matière et le rayonnement électromagnétique La base de chaque méthode spectroscopique: L’interaction de la matière à investiguée avec le rayonnement électromagnétique La matière et le rayonnement électromagnétique portent l’énergie  À certaines conditions la matière peut absorber (absorption) ou libérer (émission) le rayonnement 2014 Réponse / réaction détecteur système (les atomes, les molécules) rayonnement électromagnétique Chimie analytique instrumentale E2 émission du rayonnement émission de la chaleur énergie DE=E2-E1=hv excitation = absorption du rayonnement hv E1

Le spectre électromagnétique 2014 Energie (eV) 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 Chimie analytique instrumentale trans. magn. noyaux trans. magn. électrons Non-appariés rot. vib. trans. électrons extérieures enlévem.e- int. trans. noyau fis-sion RMN RPE Micro- onde S. IR UV/vis AAS/AES/AFS RFA Möß- bauer S. NAA

Le lien entre l’énergie, la longueur d'onde et la fréquence 2014 𝐸= ℎ×𝑐 𝜆 𝑣= 𝑐 𝜆 𝐸=ℎ ×𝑣 E = énergie mesurée en joule (J) v = fréquence mesurée en hertz (s-1 = Hz) c = vitesse de la lumière ( 299 792 458 ms-1); h = la constante de Planck ( 6,626069×10-34 Js ≈ 4,13567 feVHz-1) l = longueur d’onde mesurée en mètre (m) Chimie analytique instrumentale

Spectroscopie UV/vis M + hv  M* l = 180-800 nm E = 666-150 kJ mol-1 v = 1.67x1015-3.75x1014 Hz ṽ = 1/l = 55’226-12’500 cm-1 Spectroscopie UV/vis E2 2014 M + hv  M* énergie DE=E2-E1=hv excitation = absorption du rayonnement hv E1 Base: Excitation des électrons extérieures d’un niveau électronique à un autre Quels informations?: identification d’une substance détermination de sa concentration détermination de la cinétique d’une transformation Chimie analytique instrumentale

UV/vis - transitions Diagramme énergétique pour une molécule diatomique (A-B): 2014 Excitation des électrons extérieures d’un niveau électronique à un autre État excité (électronique) énergie Transition visible dans l’UV/vis Chimie analytique instrumentale État fondamental (électronique) Niveaux vibrationnels Transition visible dans l’IR Niveaux rotationnels séparation internucléaire

UV/vis - transitions Diagramme énergétique pour une molécule diatomique (A-B): 2014 Excitation des électrons extérieures d’un niveau électronique à un autre MAIS: Également variation des termes Evib et Erot DV = ±1; DJ = ± 1 État excité (électronique) énergie Transition visible dans l’UV/vis Chimie analytique instrumentale État fondamental (électronique) Niveaux vibrationnels Transition visible dans l’IR Niveaux rotationnels séparation internucléaire

Définition d’absorbance et transmittance Transmittance = donne la fraction de la lumière non absorbée Absorbance = mesure pour la capacité d’un milieu à absorber la lumière qui le traverse A = 0 aucune lumière est absorbée (I0=I) 2014 T = I/I0 d échantillon I0 I Chimie analytique instrumentale A = log10 . I0 /I = log10 . 1/T d = longueur de la cuve (cm) I0 = intensité de la lumière incidente I = intensité de la lumière transmise T = transmittance A = absorbance

La loi de Beer-Lambert Validité de la loi: Solution diluée et de concentration fixe e est constante  lumière monochromatique Solution transparente, non fluorescente et stable Pas de réaction avec le solvant A = e(l) x c x cd = log 1/T 2014 d = longueur de la cuve (cm) T = transmittance A = absorbance e(l) = coefficient d’extinction molaire (L mol-1cm-1) c = concentration molaire (mol L-1) Le spectre UV/vis: e(l) = l’absorbance d’une solution avec la concentration de 1 mol L-1 et une longueur de la cuve de 1cm pour la longueur de l’onde l  lmax et e(lmax) sont caractéristiques pour une substance Chimie analytique instrumentale Absorbance (A) A e(lmax) Concentration (c) lmax l

L’origine des absorptions Fréquence du rayonnement absorbé est en corrélation avec la structure de la molécule 2014 s-s*: s-orbitals contient les électrons de la liaison simple, la différence entre les OM est élevée  beaucoup d’énergie ~150 nm p.ex. méthane n-s*: molécules avec en mois un atome (O,N,S,Cl…) porteur de doublets électroniques libres (lone pair, n)  ~150-250 nm p.ex. méthanol n-p*: molécules avec en mois un atome (O,N,S,Cl…) porteur de doublets électroniques libres appartenant à un système insaturé (p*) ~270-290 nm p.ex. éthanal p-p*: molécules avec une double liaison éthylénique isolée ~170-290 nm p.ex. éthylene Chimie analytique instrumentale Les orbitals moléculaires et les transitions électroniques

L’origine des absorptions Fréquence du rayonnement absorbé est en corrélation avec la structure de la molécule 2014 np* Système conjugué pp* Système conjugué pp* np* ns* ss* Chimie analytique instrumentale Les orbitals moléculaires et les transitions électroniques

Les chromophores chromophore transition lmax (nm) électrons-s s  s* lone pair n  s* ~ 185 nm ~ 195 nm n  p* ~ 300 nm p  p* ~ 190 nm ~ 350 nm électrons-p Chromophore: groupe responsable de la couleur d’une molécule  qui porte des électrons facilement excités (n ou p) Auxochrome: groupe responsable de l’augmentation de la couleur  la fréquence d’absorption est diminuée  déplacement bathochrome p.ex.: -OH; -OR; -NH2; -Hal; -SR (n-orbitales) 2014 Chimie analytique instrumentale

L’influence sur l’absorption effet hyperchrome 2014 pp* np* 190 nm 230 nm pp* np* 190 nm 230 nm déplacement hypsochrome déplacement bathochrome effet hypochrome Chimie analytique instrumentale dénaturation / effet hyperchrome   renaturation / effet hypochrome dénaturation renaturation Absorption rel. à 260 nm Température [°C]

Système conjugué augmentation de la délocalisation diminution de DE pour la transition pp* déplacement bathochrome 2014 DE Chimie analytique instrumentale éthylène lmax = 165 nm 1,3-butadiène lmax = 217 nm 1,3,5-hexatriène lmax = 258 nm Chemistry and Physics of Lipids Volume 115, Issues 1–2, May 2002, Pages 63–76 Preparation and physical characterization of pure β-carotene Robert G. Laughlin, 1, ,  Gregory M. Bunke,  Charles D. Eads,  William D. Laidig,  John C. Shelley Miami Valley Laboratories, The Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH 45239, USA http://dx.doi.org/10.1016/S0009-3084(02)00008-7, How to Cite or Link Using DOI Permissions & Reprints Moyen pour estimer le nombre des liaisons doubles dans un molécule: n = nombre des liaisons doubles

b-carotène: colorant alimentaire antioxydant lmax= 452 nm 2013 colorant alimentaire antioxydant crèmes solaires  (agent filtrant) dépôt pour Vit.A lmax= 452 nm Chimie analytique instrumentale Chemistry and Physics of Lipids Volume 115, Issues 1–2, May 2002, Pages 63–76 Preparation and physical characterization of pure β-carotene Robert G. Laughlin, 1, ,  Gregory M. Bunke,  Charles D. Eads,  William D. Laidig,  John C. Shelley Miami Valley Laboratories, The Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH 45239, USA http://dx.doi.org/10.1016/S0009-3084(02)00008-7, How to Cite or Link Using DOI Permissions & Reprints

Le spectromètre UV/vis 2014 lampe à deutérium (UV) lampe à filament de tungstène (vis) photomultiplicateur fente d’entrée référence miroir Chimie analytique instrumentale réseau concave monochromateur échantillon fente de sortie miroirs tournants

Le spectromètre UV/vis Erreurs possibles: Solvant Cuve Mesure de l’absorbance Mesure de la longueur de l’onde Température Diffusion Largeur fente Pouvoir résolvant 2014 lampe à deutérium (UV) lampe à filament de tungstène (vis) photomultiplicateur fente d’entrée référence miroir Chimie analytique instrumentale réseau concave monochromateur échantillon fente de sortie miroirs tournants

Quelques solvants Solvant Pas utilisable sans erreur au-dessous de Eau (H2O) 200 nm Cyclohexane (C6H12) 210 nm Méthanol (CH3OH) Ethanol (CH3CH2OH) Hexane (C6H14) 215 nm Ether diéthylique ((CH3CH2)2O) Dichlorométhane (CH2Cl2) 240 nm Chloroforme (CHCl3) 250 nm Tétrachlorométhane (CCl4) 270 nm 2014 Chimie analytique instrumentale lmax peut être dépendant du solvant  sa polarité

Quelques solvants Pour les cas extrêmes, la molécule change de couleur selon la polarité du solvant  solvatochromisme Solvant Pas utilisable sans erreur au-dessous de Eau (H2O) 200 nm Cyclohexane (C6H12) 210 nm Méthanol (CH3OH) Ethanol (CH3CH2OH) Hexane (C6H14) 215 nm Ether diéthylique ((CH3CH2)2O) Dichlorométhane (CH2Cl2) 240 nm Chloroforme (CHCl3) 250 nm Tétrachlorométhane (CCl4) 270 nm 2014 Chimie analytique instrumentale Solvant lmax Polarité Anisole 771 Acétone 677 Isopentanole 588 Ethanol 550 Méthanol 516 lmax peut être dépendant du solvant  sa polarité

Spectroscopie dérivée absorption maximum/minimum point changement A(l)   dérivée première passage par zéro maximum/minimum dA(l)/dl  Dérivée seconde passage par zéro d2A(l)/dl2 2014 Chimie analytique instrumentale Absorption de longueur d'onde de testostérone et de la dérivée première de la courbe d'absorption.

Applications pour l’analyse des médicaments Avantages: Limite de détection basse Conduite facile Désavantages: - Spécificité de substances basse 2014 Absorbance spécifique = l’absorbance d`une solution avec la concentration de 1 % et une longueur de la cuve de 1cm pour la longueur de l’onde l (L g-1cm-1) On la trouve souvent dans les pharmacopées d = longueur de la cuve (cm) A = absorbance A1%1cm = absorbance spécifique (L g-1cm-1) c = concentration molaire (mol L-1) Mr = masse moléculaire Chimie analytique instrumentale

Application: Identification Mesures pour l’identification des principes actifs selon les pharmacopées : Maxima d’absorption (lmax) Maxima d’absorption (lmax) + absorption (A) dans solutions fixées Maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique Minima (lmin) et maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique (A1%1cm) Ratio entre deux maxima ou maximum et minium dans solutions fixées 2014 Chimie analytique instrumentale Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy Volume 68, Issue 2, October 2007, Pages 275–278

Application: Identification Mesures pour l’identification des principes actifs selon les pharmacopées : Maxima d’absorption (lmax) Maxima d’absorption (lmax) + absorption (A) dans solutions fixées Maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique Minima (lmin) et maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique (A1%1cm) Ratio entre deux maxima ou maximum et minium dans solutions fixées 2014 a) Aspirine acide acétylsalicylique lmax = 225 nm = 460 Chimie analytique instrumentale b) Paracétamol N-(4-hydroxyphényl) éthanamide Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy Volume 68, Issue 2, October 2007, Pages 275–278 lmax = 249 nm = 880 c) acide salicylique lmax = 235 nm = 506

Application: Pureté Le spectre d’une substance contaminée c’est l’addition du spectre de la substance pure et du spectre du contaminant 2014 Mesures pour la pureté des principes actifs selon les pharmacopées : absorption spécifique (A1%1cm) à une longueur d’onde spécifique Différence de l’absorption de deux longueurs d’onde Quotient de l’absorption de deux longueurs d’onde Production d’un dérivé pour la détection de la contamination en utilisant le dérivé Chimie analytique instrumentale

Application: Pureté Ex. 1: huile d’olive native: A(270 nm) < 0.16 Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées) 2014 Chimie analytique instrumentale

Application: Pureté Ex. 1: huile d’olive native: A(270 nm) < 0.16 Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées) 2014 Ex. 2: Apo-composé Déshydratation des b-cétol (la famille d’atropine)  déplacement bathochrome à cause de l’élongation du chromophore atropine Chimie analytique instrumentale

Application: Pureté Ex. 1: huile d’olive native: A(270 nm) < 0.16 Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées) 2014 Ex. 2: Apo-composé Déshydratation des b-cétol (la famille d’atropine)  déplacement bathochrome à cause de l’élongation du chromophore atropine Chimie analytique instrumentale Ex. 3: Phenon-formation Oxydation des épinephrines ou des autres phényle éthanol amine composés  déplacement bathochrome à cause de l’élongation du chromophore adrénaline

Application: Pureté Ex. 4: Diazotation Formation des composés azo aromatique comme preuve pour les amines aromatiques  déplacement bathochrome à cause de l’élongation du chromophore 2014 Chimie analytique instrumentale Sodium amidotrizoate composés azo aromatique

Application: détermination de la concentration 2014 Mesure de l’absorption Ax de l’analyte (ou de son dérivé) avec la concentration cx (inconnu) Détermination de la concentration cx: a) en utilisant la loi de Beer-Lambert b) en utilisant une solution comparative c) en utilisant une courbe d’étalonnage a) en utilisant la loi de Beer-Lambert si on connait e ou A1%1cm Chimie analytique instrumentale

Application: détermination de la concentration 2014 b) en utilisant une solution comparative si on ne connait pas e ou A1%1cm Ax = e x cx x d Ax /Ac = cx /cc cx = cc x Ax / Ac Ac = e x cc x d c) en utilisant une courbe d’étalonnage (le plus exact) Chimie analytique instrumentale Pour faire la courbe d’étalonnage on mesure plusieurs solutions avec une concentration connue Régression linéaire pour déterminer cx On voit aussi si la loi de Beer-Lambert est validée dans la région cherchée

Application: détermination de la concentration d’un mélange (A+B) A = e (l) x c x d Atot = AA + AB 2014 A(l1) = eA (l1) x cA + eB (l1) x cB A(l2) = eA (l2) x cA + eB (l2) x cB Il faut connaître (ou déterminer): On mesure et Équations avec 2 variables eA (l1) , eA (l2) , eB (l1) et eB (l2) A (l1) A(l2) Chimie analytique instrumentale Mélange A+B Substance A Substance B

Application: détermination de la concentration d’un mélange (A+B) 2014 Chimie analytique instrumentale Mélange A+B Substance A Substance B

Application: Analyse des réactions Salicylamide Condition préalable: changement du system chromophorique pendant une réaction Point isosbestique: A et B ont le même e à cette longueur d’onde (hasard)  absorbance est invariante pendant la transformation A B  Preuve qu’il s’agit d’une transformation direct sans intermédiaire(s) et que A et B sont en équilibre l’un avec l’autre 2014 Point isosbes. 305 nm Chimie analytique instrumentale

Application: Analyse des réactions  couplage avec le HPLC Absorbance à l1 vs t 2014 Détecteur UV Chimie analytique instrumentale

Application: Analyse des réactions  couplage avec le HPLC 2014 Absorbance à 270 nm glycosylation Chimie analytique instrumentale Vancomycin Antibiotique une inhibitrice de la synthèse du peptidoglycane de la paroi bactérienne

Application: Analyse des réactions 2014 Synthèse de peptides via SPPS: Agent de couplage Efficacité ??? Chimie analytique instrumentale Détection via UV

Applications: Analyse clinique-chimique 2014 Examen médical: - le sang / sérum du sang - la fonctionnalité du foie / du rein - l’urine - …. Photométrie  méthode simple Détection à cause: - de l’absorption d’epreuve Chimie analytique instrumentale Bromsulfophatleine (fonctionnalité du foie détection dans le sérum de sang)

Applications: Analyse clinique-chimique 2014 Examen médical: - le sang / sérum du sang - la fonctionnalité du foie / du rein - l’urine - …. Photométrie  méthode simple Détection à cause: - de l’absorption d’epreuve - d’une dérivatisation - d’une réaction enzymatique  méthode de NADH Chimie analytique instrumentale Bromsulfophatleine (fonctionnalité du foie détection dans le sérum de sang)

Applications: Analyse clinique-chimique 2014 méthode de NADH: utilisée pour - détermination des substances dans le sang, le sérum ou l’urine - détermination de l’activité des enzymes réduction oxydation Chimie analytique instrumentale Mesure à 340 nm

Applications: Analyse clinique-chimique 2014 Chimie analytique instrumentale

Applications: Analyse clinique-chimique 2014 Exemple: détermination d’alcool dans le sang  l’enzyme alcool déshydrogénase (ADH) ADH L’absorption à 340 nm est corrélée avec le taux d’alcool CH3CH2OH  CH3CHO + [2 H] NAD+ + [2 H]  NADH + H+ Chimie analytique instrumentale Mesure à 340 nm

Applications: Analyse clinique-chimique Exemple: détermination de glucose dans le sérum  indirecte 2014 hexokinase Glucose + ATP  glucose-6-phosphate + ADP NAD+ + glucose-6-phosphate  NADH + gluconate-6-phosphateH+ déshydrogenase Chimie analytique instrumentale L’absorption à 340 nm est corrélée indirecte avec le taux de glucose Mesure à 340 nm

Applications: Détection de biomolecules 2014 ADN absorbe dans le UV à lmax = 260 nm O.D.260 (densité optique) mesure  Détection d’ADN: ng/µL c = 50 µg/mL  A(260nm,1cm) = 1 Chimie analytique instrumentale protéines absorbent dans le UV à lmax = 280 nm (tryptophane, tyrosine) O.D.280 (densité optique) mesure  Détection de protéines: µg/µL c = 1 mg/mlL A(280nm,1cm) = 1

Applications: Détection de biomolecules 2014 Chimie analytique instrumentale En élevant T le nombre de simples brins augmente  absorbance à 260 nm augment jusqu’à les brins complémentaires sont complètement sépares La température de fusion (ou dénaturation) Tm (melting temperature) est la température pour laquelle 50 % des molécules d'ADN sont désappariées ou dénaturées (i.e. sous forme simple brin).

Applications: Détection de biomolecules Acide aminé l maximum ε280 nm(M-1 cm-1) Tryptophan (W) 280 nm 5690 Tyrosine (Y) 274 nm 1280 disulfide (SS) ~ 280 nm 120 ε280 nm (théorétique) = (nW x 5690 + nY x1280 + nSS x120) M-1 cm-1 2014 Chimie analytique instrumentale