Les chromatographies. titre Notions Théoriques Associées 11 TP 16

1 1. Principe. Séparation des sucres Les chromatographies sont des méthodes de séparations très précises et efficaces. Séparation des protéines 1 Pour les lipides c’est plus compliqué à cause de leur caractère polaire une phase fixe (stationnaire) Les chromatographies sont basées sur l'affinité d'un ligand pour: une phase mobile (éluant)

1 1. Principe. forte affinité faible affinité (pour la phase fixe) 1 faible affinité (pour la phase fixe) Les chromatographies sont basées sur l'affinité d'un ligand pour: une phase fixe (stationnaire) une phase mobile (éluant) Plus l’affinité de la molécule pour la phase stationnaire est grande, plus elle aura tendance à se fixer et à être ralentie. Plus l’affinité de la molécule pour la phase mobile est grande, plus elle aura tendance à être entraînée.

1 2. Les différents types de chromatographies. Plaque (Chromato sur couche mince ou CCM) Le type de support Colonne (sur colonne, HPLC,…) 1 On classe les chromatographies selon différents critères: Fixation d’AC (Affinité) Interactions ioniques (échange d’ions,…) Le type d’interaction Affinité avec les solvants (…de partage) Encombrement stérique (d’exclusion)

1 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.1. Le matériel. Silice (utilisable pour tout) Il existe 3 types de support Alumine (molécules polaires) 1 Cellulose (sucres et les acides aminés) Ether de pétrole Très nombreux de polarités variables L’éluant Benzène Ethanol, Méthanol

1 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.2. Préparation de la cuve. Préparer l’éluant Prévoir que le niveau de l’éluant n’atteigne pas la ligne de dépôt. Le verser dans la cuve 1 Permet la saturation en vapeur d’éluant. Fermer la cuve Il est important que le milieu soit le plus homogène possible pour que les migrations le soient aussi. On peut ajouter une bande de papier filtre pour accélérer le phénomène.

1 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.3. Préparation de la plaque. Activation de la plaque Passage au four pour la déshydrater. L’eau dans la silice interférerait avec l’éluant. 1 Marquer la ligne de dépôt. Préparer un patron dans une feuille de papier. Noter la position des dépôts sur la feuille. Les dépôts sont à équidistance. On laisse 1,5 cm de chaque côté.

1 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.4. Les dépôts. On dépose avec un capillaire une goutte de solution. Le dépôt doit être le plus épais possible pour obtenir des tâches distinctes. 1 Le dépôt doit être le plus étroit possible pour obtenir des tâches compactes. On dépose en plusieurs couches avec séchage au sèche-cheveux entre chaque Attention de ne pas percer ou creuser la couche de silice.

1 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.5. Migration. On place la plaque dans la cuve. 1 Les tâches ne sont pas visibles. Il faut surveiller le front du solvant. On laisse migrer. Dés qu’il approche du haut de la plaque, on la retire de la cuve. On repère le front du solvant d’un coup de crayon.

Protéines et acides aminés 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.6. Révélation. La plupart du temps, les éléments à séparer ne sont pas visibles (non colorés). On utilise un colorant, le révélateur pour les mettre en évidence. Le révélateur réagit avec les molécules et donnent des produits colorés. Ces colorations participent à l’identification des éléments. 1 Réactif de Molish Sucres Protéines et acides aminés Ninhydrine Cancérigène ! On évite de l’utiliser.

1 Rf = D migration Front solvant 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.7. Interprétation. Front du solvant On identifie les éléments grâce à deux caractéristiques: La couleur des tâches 1 En anglais « spot ». glucose galactose A la position des tâches On parle de Rf On compare avec un témoin On calcule le Rf D migration Rf = D migration Front solvant A B Témoin

Et bien, on arrête de compter les poils aux oursins et on s’y colle ! 2. Les différents types de chromatographies. 2.1. Les chromatographies sur couche mince. 2.1.7. Interprétation. Front du solvant A’y est, tu vas pouvoir complètement te la péter en disant partout que tu sais faire une CCM. 1 glucose galactose Et bien, on arrête de compter les poils aux oursins et on s’y colle ! On continuera cet exposé passionnant (je kiffe complètement ce prof…) tout à l’heure. D migration A B Témoin

3.3.1 principe illustration 2. Les différents types de chromatographies. 2.2. Les chromatographies sur colonne. Ce sont des chromato « préparatives »: on récupère physiquement les fractions séparées. mélange La phase mobile passe à l’intérieur de la phase fixe. 3.3.1 principe illustration On recueille les fractions en sortie de colonne. Ou on analyse leurs caractéristiques grâce à un « capteur ». Abs, trouble, fluorescence, conduction,... Les résultats sont présentés sous forme de graphe.

3.3.1 principe illustration 2. Les différents types de chromatographies. 2.2. Les chromatographies sur colonne. Il existe deux grandeurs possibles pour l’axe des abscisses. Le temps d’arrivée du signal. mélange Temps de rétention tr 3.3.1 principe illustration Le volume de solvant versé jusqu’à l’arrivée du signal. I du signal Volume d’élution Ve tr ou Ve