Adhérence et circulation des lymphocytes DCEM

La circulation des lymphocytes : trois dates clefs  1673 : Description des Globules sanguins par Leeuwenhoek  1964 : Gowans et Knight  1983 : Gallatin, Weissman et Butcher

Généralités  Les cellules du système immunitaire ne fonctionnent pas de façon isolée : leur maturation ou leur activation nécessitent des interactions avec de nombreux types cellulaires soit directement soit par le biais de molécules sécrétées : on parle de microenvironnement.  Les lymphocytes en particulier naissent, maturent et sont activés dans des lieux bien précis de l’organisme - les organes lymphoides primaires et secondaires.  Ces sites sont différents selon que l’on a affaire à des cellules naives ou à des cellules effectrices/mémoire  Les lymphocytes activés vont ensuite à la rencontre de l’antigène pouvant être situé n’importe où dans l’organisme (par exemple hépatocyte infecté par un virus) pour l’éliminer.  Les lymphocytes doivent donc être capables de circuler entre ces différentes zones, le sang et la lymphe servant de “moyen de transport”.

Les OLS : le lieu de rencontre avec l’antigène 1. Les lymphocytes naïfs entrent dans le ganglion via les HEV. Ils utilisent des molécules d’adhérence et des récepteurs spécifiques de molécules chimiotactiques 2. Les cellules dendritiques entrent dans le ganglion via les lymphatiques afférents en utilisant des mécanismes très voisins 3. Les cellules T se dirigent vers des zones précises du GG à la rencontre des cellules dendritiques qui présentent l’antigène. Les cellules T (qui ont le bon récepteur) s’activent 4. Les cellules T activées quittent le ganglion via les lymphatiques efférents

La circulation des lymphocytes : les mécanismes  Les lymphocytes quittent le lit vasculaire grâce à l’interaction entre  des molécules dites d’adhérence présentes à la surface des lymphocytes  et leurs ligands présents à la surface des cellules endothéliales.  Ils se dirigent spécifiquement vers des zones précises (comme par exemple les zones T ou B dépendantes dans les organes lymphoïdes secondaires ou un site inflammatoire) grâce à des récepteurs de molécules chimiotactiques (chimiokines, PAF, leucotriènes, C3bi).  Ces molécules chimiotactiques peuvent être spécifiques de certains sites (tube digestif, peau) ou produites seulement en cas d’inflammation

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence Ley K. et al, Nature Rev Immunol 2007, 7,  Les cellules du système immunitaire quittent le sang pour entrer dans les organes lymphoides secondaires ou les tissus par un mécanisme à plusieurs étapes :  Capture / roulement  Activation de l’adhérence forte  Arrêt  Migration transendothéliale  Implique plusieurs classes de molécules  Molécules d’adhérence  Molécules solubles comme les chimiokines  Récepteurs des chimiokines

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence Ley K. et al, Nature Rev Immunol 2007, 7,  Les cellules du système immunitaire quittent le sang pour entrer dans les organes lymphoides secondaires ou les tissus par un mécanisme à plusieurs étapes :  Capture / roulement  Activation de l’adhérence forte  Arrêt  Migration transendothéliale  Implique plusieurs classes de molécules  Molécules d’adhérence  Molécules solubles comme les chimiokines  Récepteurs des chimiokines

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence Ley K. et al, Nature Rev Immunol 2007, 7,  Les cellules du système immunitaire quittent le sang pour entrer dans les organes lymphoides secondaires ou les tissus par un mécanisme à plusieurs étapes :  Capture / roulement  Activation de l’adhérence forte  Arrêt  Migration transendothéliale  Implique plusieurs classes de molécules  Molécules d’adhérence  Molécules solubles comme les chimiokines  Récepteurs des chimiokines

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence Ley K. et al, Nature Rev Immunol 2007, 7,  Les cellules du système immunitaire quittent le sang pour entrer dans les organes lymphoides secondaires ou les tissus par un mécanisme à plusieurs étapes :  Capture / roulement  Activation de l’adhérence forte  Arrêt  Migration transendothéliale  Implique plusieurs classes de molécules  Molécules d’adhérence  Molécules solubles comme les chimiokines  Récepteurs des chimiokines

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence  Le type de molécules et leur niveau d’expression dépendent :  Du type cellulaire (lymphocyte, monocyte, polynucléaire, cellule endothéliale)  De l’état de différenciation (lymphocyte naïf, mémoire…)  Des conditions physiologiques (état basal, inflammatoire)

La circulation des lymphocytes : la cascade d’adhérence

Les sélectines o La famille des sélectines est composée de 3 membres (P-, E-, L-sélectine) o Toutes sont impliquées dans les phénomène de roulement des leucocytes le long de l’endothélium o Leurs ligands sont des molécules sucrées (principalement tétrasaccharides sialyl Lewis x, sLe x ) fixées sur des cores protéiques. o Les P-sélectines  sont stockées dans des granules situées dans les cellules endothéliales et les plaquettes  Elles peuvent transloquer rapidement à la membrane sous l’influence de stimuli inflammatoires  Des cytokines inflammatoires (comme le TNF-  et l’IL-1) entraînent une augmentation de leur expression par augmentation de la transcription. o Les E-sélectines  présentes uniquement sur l’endothélium  Leur expression est régulée par les cytokines inflammatoires o Les L-sélectines  Exprimées à la surface de sous-populations leucocytaires  Rapidement effeuillées après activation

Les intégrines Nat Rev Drug Discov 2010 ; 9 ; 804  Les intégrines sont des hétérodimères (  ) exprimées constitutivement à la surface de la plupart des types cellulaires dont les leucocytes. o Elles sont impliquées dans les interactions cellules-cellules et cellules-matrice extra cellulaire  Actuellement 19 chaînes  et 8 chaînes  ont été identifiées qui forment 25 hétérodimères (1 chaîne  peut se lier à plusieurs chaînes  et inversement) o Leur expression est extrêmement variable d’un type cellulaire à l’autre.  Certaines sont restreintes à des types cellulaires ou des lignées (  2 intégrines et leucocytes,  E  7 et lymphocytes muqueux)  Importance des intégrines de la famille  2 et de la famille  4 (  4  1 (VLA-4) et  4  7) et de leurs ligands

Les intégrines o Elles se présentent à la surface des leucocytes dans un état de basse affinité pour leurs ligands o Après activation elles deviennent capables de reconnaître leurs ligands situés sur d’autres cellules ou dans la matrice extra-cellulaire :  Protéines de la matrice extra-cellulaire : FN, TSP, VN, collagènes  Molécules de surface : ICAMs, VCAM, MadCAM (famille des CAMs)... o L’activation se fait par la stimulation de voies de signalisation intra- cellulaires déclenchées par différents stimuli (peptides bactériens, chimiokines, activation du TCR...) o Ce mécanisme d’activation est appelé « inside-out » et induit 2 phénomènes :  L’augmentation affinité : changement conformationnel  L’augmentation d’avidité : diffusion latérale permettant la formation de clusters d’intégrines o Elles sont impliquées dans les phénomènes d’arrêt ferme mais aussi de roulement des leucocytes le long de l’endothélium.

Les intégrines

 A côté des fonctions « adhérence » les intégrines transmettent des signaux et sont impliquées dans de très nombreux rôles :  Survie cellulaire  Contrôle de l’organisation du cytosquelette  Motilité cellulaire  Prolifération cellulaire  Contrôle de la transcription de gènes  Leur distribution très large et leurs fonctions variées font qu’elles interviennent (parfois de façon critique) dans de nombreux phénomènes comme l’embryogénèse, la coagulation, la cicatrisation… o Leur importance a été mis en évidence dans des défauts génétiques chez l’homme :  Plaquettes : GT mutations GPIIb/IIIa (intégrine  IIb  3)  Leucocytes : LAD I et LAD I variants (ou LAD III)  Peau : Épidermolyses bulleuses (  4  6)  Muscle : Myopathies congénitales (mutations de la chaîne  7)

LAD (Leukocyte Adhesion Deficiency Disease)  LAD type I : Rares (environ 300 cas) Pas ou peu d’expression en surface des intégrines de la famille  2 Formes sévères (<1%) ou modérées (2.5-10%) Le fonctionnement des neutrophiles est fortement altéré car ils utilisent les  2 intégrines pour adhérer à l’endothélium, migrer, ingérer des microorganismes recouverts de C3bi Neutrophilie paradoxale en cas d’infection, sans pus Compensation par d’autres intégrines car pas d’infections virales majeures ni de trouble de HSR  Il existe d’autres formes qui peuvent correspondre : à un défaut de transmission du signal par les intégrines à un défaut congénital de fucosylation des ligands des sélectines (et d’autres glycoprotéines)

LAD : expression de la chaîne  2 de la famille des intégrines

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques)  Initialement identifiées comme une famille de petites molécules induites par l'inflammation et capables d'attirer les leucocytes au cours de l'inflammation.  Plus de 50 identifiées à ce jour  protéines de 8 à 10 kDa avec % homologie  Toutes les chimiokines (sauf 2 qui sont fixées à la membrane plasmique) sont sécrétées.

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques)

 Elles permettent :  d’activer les intégrines et d’induire une adhérence forte  de contrôler la circulation des leucocytes dans les tissus (par exemple l’étude des souris déficientes en SDF-1 montrent son rôle critique dans la migration des précurseurs myéloïdes du foie foetal vers la moelle osseuse)  Au cours de l’inflammation la sécrétion de chimiokines est augmentée considérablement et permet l’afflux des leucocytes dans les tissus inflammatoires.  Dans les maladies inflammatoires la sécrétion de chimiokines est impliquée dans la migration et l’activation des leucocytes (cibles thérapeutiques).

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques)  Sont classifiées sur un plan structural en 2 grandes sous-familles (comprenant plus de 50 chimiokines) avec  2 ponts disulfures et 4 cystéines   chemokines : CXC   chemokines : CC  Les C chimiokines (2 chimiokines les lymphotactin  et  ) et CX3C chimiokine (Fractalkine) sont des sous-familles mineures.  Classification physiologique :  inflammatoires (ou inductibles)  homéostatiques (ou constitutives, lymphoïdes)  double fonctions

Les 4 familles de chimiokines CXC chimiokines CC chimiokines

Les chimiokines (ou cytokines chimiotactiques)  Chimiokines inflammatoires (ou inductibles)  Leur source majeure sont les cellules endothéliales activées, les cellules épithéliales, les leucocytes (mais après activation - LPS - pratiquement n’importe quelle cellule peut en produire)  Elles sont peu spécifiques agissant sur les cellules de l’immunité naturelle et acquise.  Elles contrôlent le recrutement des cellules effectrices au cours de l’inflammation, des infections, des tumeurs, des lésions tissulaires  Chimiokines homéostatiques (ou constitutives, lymphoïdes, housekeeping)  produites principalement dans les tissus lymphoides.  elles contrôlent la circulation des leucocytes au cours de l’hématopoïèse (MO, Thymus), de la surveillance des tissus, de l’initiation de la réponse immune (circulation entre GG, rate, plaques de Peyer).  Elles ont un rôle majeur dans la maturation lymphocytaire en permettant l’entrée ou la sortie d’un micro-environnement donné à un stade précis

Les chimiokines (ou cytokines chimiotactiques)  In vivo les chimiokines sont immobilisées sur la matrice extra-cellulaire ou à la surface cellulaire liée à des glycosaminoglycans.  Permet de faire des gradients (évite que les chimiokines ne soient emportées dans le torrent circulatoire par exemple)  Il existe 2 régions dans la partie Nt permettant  La fixation à un récepteur spécifique  La fixation à la matrice ou à la surface cellulaire

Les récepteurs des chimiokines  Molécules heptaspanes  19 récepteurs connus actuellement  6 CXCR (récepteur des  chemokines)  11 CCR (récepteur des  chemokines)  1 CX3CR  1 XCR  Les couples chimiokines-récepteurs ne sont en général pas spécifiques  Sont également exprimés sur d’autres types cellulaires (neurones, cellules épithéliales, endothéliales...)  autres rôles que le chémotactisme  Récepteurs d’agents infectieux (HIV, paludisme )

Récepteurs des chimiokines : un exemple en dehors du système immunitaire

HIV et chimiokines : un long chemin ensemble  Découverte de facteurs HIV-suppresseurs synthétisés et libérés par les lymphocytes T CD8+ puis identifiés comme étant des chimiokines inflammatoires (1995) :  RANTES (CCL5)  MIP-1  (CCL3)  MIP-1  (CCL4)  Identification en 1996 d’un second co-récepteur cellulaire pour le HIV qui est aussi un récepteur pour une chimiokine (CXCR4)  Identification d’un autre récepteur de chimiokine (CCR5)

Este JA, The Lancet 2007, 370, HIV et chimiokines : un long chemin ensemble  Gp120/gp41 viral se fixe sur le CD4 (sous-population des cellules T et macrophages)  Co-récepteurs : CXCR4 (entrée dans les cellules T) et CCR5 (entrée dans les macrophages et T activés)  Intégrine  4  7 (activée)

HIV et chimiokines  Homozygotes CCR5  32 et hétérozygotes  Pas de déficit immunitaire apparent notable chez ces patients suggérant que le blocage pharmacologique de CCR5 serait relativement bénin (mais n’écarte pas une action croisée sur d’autres récepteurs de chimiokines)  Associé également à un risque diminué (asthme), une évolution moins sévère (polyarthrite rhumatoïde), un début retardé de la maladie (sclérose en plaque) suggérant un rôle immunosuppresseur.  Mortalité augmentée dans infection du virus du Nil

HIV et chimiokines

La circulation des lymphocytes : les mécanismes

Stem cells Pre BPre T B cells Pre T Thymus T cells Memory lymphocytes naive lymphocytes Memory lymphocytes Bone marrow Blood Peripheral non lymphoid tissue Secondary lymphoid tissue (LN, spleen, PP) Ag presentation Memory lymphocytes naive lymphocytes afferent lymphatics

L’entrée dans un tissu d’un lymphocyte dépend de l’expression différentielle des molécules d’adhérence et des récepteurs des chimiokines Ganglion

Cellules T naives et mémoire expriment différents récepteurs de chimiokines et molécules d’adhérence

Le rôle du microenvironnement dans les phénomènes de homing  Les capacités d’entrée dans un tissu des cellules T mémoires depuis la circulation sont variables  On distingue, selon les mécanismes d’entrée, 2 types de tissu :  Les tissus à entrée “restreinte”  Les tissus à entrée “libre”  Les molécules impliquées dans les sites à “entrée libre” (LFA-1, VLA-4, CD44, PSG-L1) sont sur- exprimées sur l’ensemble des lymphocytes mémoires  Par contre les sites à “entrée restreinte” (peau, tube digestif, système nerveux) sont colonisés par des cellules mémoires qui doivent exprimer un jeu particulier de molécules d’adhérence et de récepteurs de chimiokines. Nature Review Immunology, 2009, 9, 153

La circulation des lymphocytes à l’état basal Nature Review Immunology, 2011, 11, 597

Le rôle du microenvironnement dans les phénomènes de homing  Le microenvironnement dans lequel la cellule T est activée est essentiel dans la formation de cellules qui vont devenir capables de retourner dans le même type de tissus  Les cellules dendritiques de la peau (vitamine D) ou du tube digestif (acide rétinoïque) vont favoriser l’expression de récepteurs de chimiokines spécifiques aux chimiokines sécrétées par la peau ou le tube digestif  Les cellules effectrices T vont alors pouvoir retourner dans le tissu qui leur a “donné naissance”

Les lymphocytes coopèrent pour l’entrée dans les tissus

C’est pas le tout d’entrer, il faut aussi sortir…

2 affections Th1 et 2 affections Th2 : les mécanismes qui sous-tendent la migration tissulaire sont identiques (bien que les molécules impliquées soient différentes). Au cours des maladies inflammatoires, l’entrée des cellules immunitaires dans les tissus cibles obéissent aux mêmes mécanismes

Les CAMs leucocytaires et endothéliaux cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires ? NEJM 1998 ; 338 ; 436 o L’inflammation est une réponse physiologique majeure (et bénéfique) de l’organisme à l’invasion d’agents infectieux et à l’agression tissulaire o Inappropriée, non ou mal contrôlée, persistante, elle devient néfaste et conduit à, contribue à ou aggrave de nombreuses pathologies (ischiémie- reperfusion, maladies inflammatoires, auto-immunes…) o Le recrutement des leucocytes sanguins vers les tissus est essentiel à la réaction inflammatoire. o Survient au cours d’un processus comprenant plusieurs étapes séquentielles (et plus ou moins superposées) o Le blocage d’une de ces étapes (par interférence avec une molécule clef) devrait permettre de bloquer le processus dans son ensemble

Les CAMs leucocytaires et endothéliaux cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires ?  Des modèles précliniques très prometteurs  Des résultats cliniques décevants pour les sélectines et l’intégrine  2 (avec des exceptions comme psoriasis, asthme) en particulier dans les syndromes d’ischiémie-reperfusion.  Surestimation de l’importance réelle de ces voies ?  Voies redondantes ?  L’effet des anti-  L pourrait être secondaire à d’autres effets que le blocage de LFA-1  en particulier intervient dans la présentation de l’antigène par les cellules de Langherans ;  La migration transendothéliale ;  interactions entre cellules T et kératinocytes  A l’opposé cibler les  4 intégrines est efficace dans plusieurs maladies (IBD, MS)  Maladies pour lesquelles les lymphocytes jouent un rôle prépondérant  Autres modes d’action (exocytose, production de cytokine, motilité..)  Moins immunosuppresseur que les anti-  2 (qui miment LAD-I & II)  Efficacité et effets secondaires à long terme ?

Inhiber la migration cellulaire dans les maladies inflammatoires ?

Le psoriasis  Maladie chronique et incurable  Infiltration dermique et epidermique par des neutrophiles et des cellules T activées  LFA-1 est impliquée dans de nombreux mécanismes :  activation des cellules T dans les organes lymphoides secondaires,  la circulation lymphocytaire et la migration dans la peau,  la reactivation des cellules T dans la peau et  les interactions lymphocytes T avec les keratinocytes  Utilisation d’un anticorps humanisé dirigé contre LFA-1 (efalizumab)  Retiré du marché en 2009 (PML) Effet de l’anticorps anti LFA-1 Effet du placebo Amélioration du psoriasis (amélioration du PAS index)

Sclérose en plaque : physiopathologie  Plusieurs types de cellules immunitaires entrent dans le système nerveux central  Les lymphocytes T centraux mémoire (TCM) passent des veinules post capillaires des plexus choroides dans le stroma (1) puis à travers l’épithélium des plexus choroïdes dans le LCR (2).  Ces TCM ont pour fonction la surveillance du SNC  Les lymphocytes T effecteurs mémoire activés et les monocytes passent de la circulation intra cranienne dans les sites inflammatoires à travers la barrière méningée  Toutes ces cellules expriment l’intégrine  4  1 (le contre récepteur sur l’endothélium ou les plexus choroïdes n’est pas formellement identifié)  Leur circulation est perturbée par le natalizumab (anticorps anti-  4)

Sclérose en plaque  En 1990 le rôle de l’intégrine  4  1 dans la migration des lymphocytes vers le SNC est démontré dans les modèles de rat atteints de SEP (EAE)  Ac anti-  4 diminuent le nombre de lésions dans les modèles animaux de SEP  Montré chez l’homme (patients atteints de sclérose en plaque traités soit avec un anticorps humanisé anti a4 intégrine (natalizumab) soit un placebo)  Evalué sur l’apparition de nouvelles lésions neurologiques détectées par imagerie cérébrale au cours des 6 mois suivants le traitement  9.6 par patient pour le groupe placebo  0.7 a 1.1 pour les groupes natalizumab Effet de l’anticorps anti a4 intégrine Effet du placebo Nbre de nouvelles lésions

Chimiokines et immunité non spécifique  Les chimiokines jouent également un rôle important dans les liens entre immunité innée et immunité acquise.  En particulier les cellules dendritiques activées par des dérivés microbiens (peptidoglycans des BGP, lipoprotéines bactériennes, DNA bactérien contenant des dinucléotides déméthylés CpG) et chargées de l’antigène migrent vers les organes lymphoïdes secondaires pour activer le système immun spécifique.  De plus les macrophages et les cellules dendritiques activés, sécrètent en périphérie des chimiokines qui attirent différentes classes de leucocytes.

Chimiokines et immunité non spécifique 2. L’activation des cellules dendritiques via les TLR module l’expression de certains récepteurs de chimiokines leur permettant de quitter la périphérie pour aller vers les lymphatiques, direction les organes lymphoïdes secondaires.

Chimiokines et immunité non spécifique 1. Les cellules dendritiques immatures quittent le sang et entrent dans les tissus grâce à des récepteurs de chimiokines (CCR1, 2, 5, 6, 9, CXCR4) 2. Après activation et phagocytose de l’antigène, elles expriment du CCR7 et entrent dans les lymphatiques, direction organes lymphoïdes secondaires. 4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines permet d’attirer et de faire entrer les lymphocytes effecteurs et mémoires. 3. Dans les organes lymphoïdes secondaires, les cellules dendritiques présentent l’antigène.

Chimiokines et immunité non spécifique 4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines induite par les TLR permet d’attirer et de faire entrer les leucocytes.

Chimiokines et immunité non spécifique 4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines par les CTLs permet de recruter et d’amplifier la réponse immune.

Molécules d’adhérence/chimiokines et cancer  De nombreux cancers humains développent un réseau complexe de chimiokines et expriment des récepteurs de chimiokines  La production de chimiokines, l’expression des récepteurs des chimiokines, des molécules d’adhérence et leur signalisation sont modifiées  Les conséquences sont multiples :  Contrôler l’importance et la composition de l’infiltrat leucocytaire  Modifier la réponse immune  L’angiogénèse  La croissance de la tumeur (croissance et apoptose)  Migration

Molécules d’adhérence/chimiokines et cancer Nature Review Immunology, 2011, 11, 597

Chimiokines et Cancer  Les récepteurs des chimiokines peuvent être exprimés sur des cellules cancéreuses (expression normale sur le tissu d’origine, expression aberrante, expression induite par l’hypoxie)  contribue à l’apparition de métastases dans des lieux précis  Cancer du sein : expriment CXCR4 et CCR7 dont les ligands (chimiokines) se trouvent dans les ganglions, le foie, les poumons, la moelle osseuse  Mélanomes malins expriment en plus CCR10 (dont le ligand CCL27 –CTACK- est exprimé au niveau de la peau) Nature Review Immunology, 2011, 11, 597

Chimiokines et cancer : l’implication des récepteurs des chimiokines dans les métastases des cancers du sein Nature 2001 ; 410 ; 50

Perturbation de la cascade d’adhésion leucocytaire  L’infiltration lymphocytaire des tumeurs est en règle générale associée à un meilleur pronostic : cela souligne le role anti tumoral du système immunitaire  Un des moyens developpé par les tumeurs pour échapper au systeme immunitaire est de perturber la cascade d’adhésion leucocytaire au niveau des vaisseaux tumoraux  Les tumeurs modulent l’expression de nombreuses molécules d’adhérence  Résulte dans un recrutement “choisi” des leucocytes  Le flux sanguin et la pression interstitielle sont également perturbés Castermans K et al, BBA 2007, 1776,

Chimiokines et cancer  Les chimiokines et les molécules d’adhérence sont sans aucun doute importantes  mais s’agit cependant de processus très complexes impliquant de très nombreux facteurs : altérations génétiques, adhésion, microenvironnement… McSherry EA et al, Cell Mol Life Sci 2007, 64,

Au total…