LE CARYOTYPE HUMAIN Techniques conventionnelles Hélène ZATTARA

Étude morphologique du matériel chromosomique se présentant sous la forme de chromosomes dans les cellules des eucaryotes l ’étude du caryotype correspond au dénombrement et à l ’identification de tous les chromosomes cellules en métaphase (prophase) anomalies de nombre et anomalies de structure

Qu’est ce qu ’un chromosome? Chromosome constitué d ’une molécule d ’ADN associée à de nombreuses protéines les chromosomes servent de support à l ’information génétique nombre de chromosomes par cellule caractéristique d ’une espèce chez l ’homme 46 chromosomes (2 jeux haploides de 23 chromosomes)

Centromère Constriction primaire Structure complexe Etroitement associé à une structure protéique : le kinétochore Sépare en 2 le chromosome : bras court p Bras long q Index centromérique = p/p+q

Constrictions secondaires Chromosome 1 Chromosome 9 Chromosome 16 Chromosome Y

Constrictions 1aires et 2aires Constituées d’ADN hautement répétitif : hétérochromatine constitutive (ainsi qu’au niveau des bras courts des chromosomes acrocentriques) 10% génome humain

ADN satellites ADN  satellite : sur toutes les paires chromosomiques localisé dans les régions centromériques ADN  satellite : localisé dans les régions péricentromériques des chromosomes 1, 9 et Y et sur les bras courts des chromosomes acrocentriques

ADN satellites ADN sat 1 : réparti sur de nombreux chromosomes ADN sat 2 et 3 :dans les régions centromériques et régions hétérochromatiques des chr 1, 9, 16 et Y. Ils seraient également impliqués dans le mécanisme de remaniement des chromosomes acrocentriques

centromère Étroitement lié à une structure protéique : le kinétocore sur lequel s’insère les fibres fusoriales lors de la métaphase (complexe jouant un rôle essentiel dans la séparation des chromosomes)

Télomère Maintiennent l’intégrité des chromosomes et ont des propriétés répulsives Constitué d’une séquence de 6pb 5’TTAGGG3’ longueur 2 à 30 kb

Techniques d ’obtention des prréparations métaphasiques Chromosomes visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire : division toutes les techniques visent à obtenir un maximum de cellules bloquées à ce stade cellules en multiplication active soit spontanément soit par une culture

Prélèvements Sang fibroblastes cellules amniotiques, villosités choriales,sang fœtal moelle osseuse tissu tumoral ou ganglionnaire

Cultures cellulaires Stérilité +++ milieu de culture stérile avec des antibiotiques et antifungiques milieu de culture : milieu synthétique enrichi en sels minéraux, glucose et acides aminés auquel on additionne du sérum de veau fœtal

Sang :caryotype constitutionnel Sang total + milieu de culture phytohémaglutinine (stimulation des lymphocytes T) 72 heures à l ’étuve

Sang et moelle : hémopathies malignes Rincer les cellules dans du milieu de culture puis centrifugation récupération de l ’anneau des cellules mononucléées numération cellulaire mise en culture en flacon Falcon +/- mitogènes

Tissus solides Dilacération du fragment dans une boite stérile avec du milieu de culture numération des cellules dans le surnageant mise en culture en flacon Falcon surveillance quotidienne au microscope inversé

Cultures cellulaires Air enrichi en CO2 pH compris entre 7.2 et 7.4 température stable de 37°C temps de culture variable en fonction du prélèvement

Arrêt de la culture Agent bloquant du fuseau mitotique (colchicine ou sulfate de vinblastine) permet de bloquer les cellules en métaphase

Choc hypotonique Indispensable à l ’obtention d ’un étalement correct des chromosomes KCl ou MgCl2 éclatement des membranes cellulaires et dispersion des chromosomes

Fixation des préparation métaphasiques 3 fixation avec un mélange éthanol/acide acétique on obtient un culot de cellules fixées que l ’on remettra en suspension pour l ’étape suivante : étalement sur lame

Etalement des préparations chromosomiques sur lame L ’étalement a pour but d ’obtenir des métaphases avec des chromosomes bien séparés et non réfringents Faire tomber une ou 2 gouttes de suspension cellulaire sur une lame étape dépendantes des conditions atmosphériques enceinte thermostable

Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 1/ TK directe a/Giemsa permet de compter les chromosomes classement en fonction de la taille et de l ’index centromérique

Giemsa

Bandes Q

Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 2/ Techniques de dénaturation bandes G coloration au Giemsa après dénaturation à la trypsine avantage : technique rapide inconvénients : les télomères apparaissent peu colorés

Bandes G

Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 2/ Techniques de dénaturation bandes R coloration au Giemsa après dénaturation thermique en mileu salin à pHdéterminé résultat en négatif des bandes G avantage : les télomères sont bien colorés inconvénients : technique longue et dépendante de nombreux paramètres

Bandes R

Chromosome 4 Bandes G Bandes R

Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 3/Techniques de marquage complémentaires bandes C : hétérochromatine constitutive NOR : organisateurs nucléolaires

Bandes C

Coloration NOR :imprégnation argentique

Technique de haute résolution Chromosomes déspiralisés en prométaphase visualisation des sous-bandes chromosomiques Synchronisation des cultures associée à l ’incorporation d ’analogues de bases (bromodésoxyuridine ou BrdU) modification des propriétés tinctoriales des bandes chromosomiques 700 à 1000 bandes

Observation au microscope Visualisation des lames au microscope optique 20 métaphases au moins sont photographiées et analysées logiciel de saisie d ’image et logiciel d ’analyse

Classement du caryotype Caryotype humain : 46 chromosomes autosomes : 1 au 22 gonosomes: X et Y femme : 46,XX homme : 46,XY

Classement du caryotype Index centromérique rapport p/(p+q) chromosomes métacentriques IC=0.5 (chr 1,3,16,19,20) chromosomes submétacentriques IC=0.4 (chr 2,6,7,X,8,9,10,11,12) chromosomes subtélocentriques IC=0.2 (chr 4,5,17,18,Y) chromosomes acrocentriques (chr 13,14,15,21,22)

Aspects morphologiques Subtélocentriqueses

Classement des chromosomes Fonction de leur taille de leur index centromérique de la reconnaissance après marquage de chaque chromosome : nombre et répartition des bandes spécifique à chaque paire chromosomique Nomenclature internationale définit pour chaque chromosome des régions chromosomiques qui comporte des bandes et des sous-bandes

Classement du caryotype Groupe A : 1 2 3 Groupe B : 4 5 Groupe C : 6 à 12 X Groupe D : 13 14 15 Groupe E : 16 17 18 Groupe F :19 20 Groupe G :21 22

21 q 22.3 région: 1 - 4 N°chromosome bande bras sous-bande

Variants normaux Différence de taille entre les chromosomes 1, 9, 16 homologues du fait d’une différence de taille des constrictions secondaires Présence de satellites géants ou de double satellites sur les chromosomes acrocentriques Y

Chromosome 1

Anomalies chromosomiques Constitutionnelles : anomalies chromosomiques survenues avant la fécondation ou lors des 1ères divisions du zygote Acquises : anomalies chromosomiques apparues au cours de la vie et ne touchant qu ’un seul organe

Anomalies chromosomiques Homogènes : toutes les cellules présentent l ’anomalie chromosomique En mosaïque : 2 populations à caryotype différent issues du même zygogte anomalies chromosomiques héritées anomalies chromosomiques de novo

Anomalies chromosomiques Anomalies de nombre Anomalies de structure équilibrées deséquilibrées

Indication du caryotype 1/chez le nouveau-né nouveau-né mort-né ou décédant à la naissance nouveau-né vivant présentant un tableau clinique évocateur d ’une aberration chromosomique nouveau-né vivant présentant un tableau malformatif ou dysmorphique atypique

Indication du caryotype 2/ chez l ’enfant chez le garçon : handicap mental moyen ou profond chez la fille : -retard de croissance -hernie de la gonade 3/ chez l ’adolescent anomalies de la puberté

Indication du caryotype 4/ chez l ’adulte naissance d ’un enfant présentant une anomalie chromosomique fausses couches spontanées à répétition stérilité masculine ménopause précoce

Indication du caryotype en hématologie cancérologie Processus cancéreux très souvent associés à des remaniements chromosomiques ,parfois spécifiques Intérêt du caryotype diagnostique pronostique thérapeutique

Indication du caryotype en haute résolution Examen de 2ème intention préciser les points de cassures d ’un remaniement dépisté sur un caryotype standard rechercher un microremaniement quand la clinique évoque trés fortement l ’existence d ’une anomalie chromosomique et que le caryotype standard est normal