Deuxième signal de costimulation et troisième signal de progression du cycle cellulaire Pr Emmanuel Morelon Service de Transplantation Hôpital Edouard Herriot Lyon

Activation et prolifération lymphocytaire T

Activation lymphocytaire T rôle des quatre signaux TCR Antigène HLA Classe II Calcineurine NFAT IL2 Signal 1 CD28 B7-1,2 Signal 2 costimulation IL2R IL2 Signal 3 CD40L CD40

Nécessite la synthèse d’acides nucléiques à partir de bases puriques ou pyrimidiques signal de mitose et de prolifération clonale Le signal 4 : Y. Lebranchu

Signal 2 Costimulation lymphocytaire

Mise en évidence du rôle de la costimulation lymphocytaire

Les différents couples ligands récepteurs impliqués dans la costimulation lymphocytaire Molécules de la costimulation sur la CPA Récepteurs lymphocytaires de costimulation Répartition cellulaire Répartition cellulaire Autres noms Noms usuels CD, monocytes, Macrophages, LT Mémoires LB centres germinatifs B7.1 sur CD et LB B7.2 sur CD, LB, monocytes CD, LB, monocytes Induit sur LB et CD par La liaison CD40/CD40L, Cellules endothéliales Transitoirement Sur LT, LB, après activation CD matures Et LB activés LFA3CD58CD2LFA2 LT B7.1CD80 CD28Tp44 LT4 (95%) LT8 (50%) B7.2CD86 ICOSL B7h/B7RP-1 B7-H2ICOS LT activés TNFSF4OX40LCD134 OX40 TNFRSF4 LT4 et LT8 activés CD27L TNFSF7 CD70CD27TNFRSF7 LT et LB 4-1BBL TNFSF9 CD BB TNFRSF9 LT4 et LT8 activés A. Brossay Le courrier de la Transplantation 2001 Vol1 N2 CD40CD40L

Cellule T CD28 CD40 CD2 TCR LFA1 ICAM-1 CD80/86 CD58 CPA CMH peptide A TNF  Lt  TRANCE Cellule T CD28 CD40 CD2 TCR LFA1 ICAM-1 CD80/86 CD58 CPA CMH peptide B Cellule T CD28 CD40 CD2 TCR LFA1 ICAM-1 CD80/86 CD58 CPA CMH peptide C CD28 CD40 LFA1 ICAM-1 CD80/86 CD58 CPA CMH peptide D Cellule T CD28 CD40 CD2 TCR LFA1 ICAM-1 CD80/86 B7-H2 CPA CMH peptide E Cellule T CD28 CD40 LFA1 ICAM-1 CD80/86 CPA CMH peptide F Cellule T ICOS CD154 Activation CPA Synapse immunologique Signal 1 et 2 Icos et CD40L + Surexpression molécules costimulation B7-H2 ICOS CD154 Nouveaux signaux de costimulation

Activation lymphocytaire T mécanismes de contrôle TCR Antigène HLA Classe II Calcineurine NFAT IL2 Signal 1 CD28 B7-1,2 Signal 2 costimulation IL2R IL2 Signal 3 CTLA4 B7-1,2 Signal négatif Contrôle de la prolifération

Mécanismes de contrôle de l’activation lymphocytaire par CTLA4 L’activation lymphocytaire induit l’expression membranaire de la molécule CTLA4 CTLA4 se lie à B7 1,2 avec une affinité supérieure à CD28 La liaison de CTLA4 à son ligand entraîne un signal d’arrêt de prolifération cellulaire Les mutations entraînant un défaut d’expression membranaire de CTLA4 induisent une lymphoprolifération et des signes d’autoimmunité

Blocage de la costimulation lymphocytaire : un moyen d ’induire la tolérance ?

Blocage du cosignal chez la souris: des débuts très prometteurs dans l ’induction de tolérance Nature Vol May 1996

Matériel et méthodes Modèle de greffe allogénique chez la souris Souris receveuse C3HJ Greffe de cœur ou de peau provenant de BALBC CTLA4Ig : protéine de fusion qui se lie de façon spécifique à B7.1 et B7.2 et qui inhibe la liaison au CD28 Traitement par anti-CD40 ligand (MR1), CTLA4Ig, ou les deux Traitement pendant quelques jours au moment de la greffe, puis arrêt Contrôle par antiCD4, ciclosporine, ou Ig non spécifiques

TCR Antigène HLA Classe II Calcineurine NFAT IL2 Signal 1 CD28 B7-1,2 Signal 2 costimulation IL2R IL2 Signal 3 CD40L CD40 CSA MR1= mAb CTLA4Ig Blocage du cosignal chez la souris

MR1 = Anti CD40L Survie des greffes de coeur n=7 n=12 n=7 CTLA4Ig : j 0, 2, 4 et 6 MR1 : j 0, 2, 4

Survie des greffes de peau chez la souris YTS191= anti-CD4

Conclusion : Bases de l ’induction de tolérance par l ’inhibition de la costimulation Un traitement court par CTLA4-Ig et anti-CD154 induit une tolérance à long terme d ’une greffe de cœur et de peau Le blocage d ’une seule voie de costimulation n ’est pas suffisant pour induire une tolérance Effet combiné du blocage de deux voies de costimulation Prévention du rejet chronique si anti-CD40L combiné avec CTLA4-Ig Effet inhibiteur de la ciclosporine : attention aux thérapeutiques non spécifiques associées

Induction de tolérance par blocage du cosignal chez le primate Travaux par A.Kirk et al PNAS 1997 Nat Med 1999 Transplantation 2001

Matériel et méthodes Singes Rhesus Allotransplantation rénale Blocage du cosignal par CTLA4-Ig et/ou Anti-CD40L par mAb 5C8, puis hu5C8 Traitement associé ou non à des immunosuppresseurs conventionnels

Kirk et al PNAS 1997 Vol 94 pp In vivo : kidney function and survival AR No treatment CTLA4-Ig alone 10 mg/kg d 1 to d5 CTLA4-Ig alone 20 mg/kg d 1 and 10 mg/kg every other day d1 to d12 5C8 alone 20 mg/kg every other day d1 to d14 Retreatment with 5C8 CTLA4-Ig and 5C8 d 0, 2, 4,6,8,10,12 CTLA4-Ig and 5C8 d 0, 2, 4,6,8,10,12, 16, 28

Conclusion This drug combination prolonged allograft survival for more than 9 months after drug withdrawal, but this brief treatment failed to lead to indefinite graft survival hu5C8 (anti-CD40L) alone is better than CTLA4-Ig alone

Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 (CD40L)prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates Traitement en monothérapie de façon prolongée par hu5C8 20 mg/kg d 0, 1, 3, 10, 18, 28, and every 28 days for 5 months Essaie avec les autres immunosuppresseurs

Conventional immunosuppressants worsen the long term outcome after transplantation with hu5C8 hu5C8 n=9 No treatment n=4 hu5C8 + chronic MMF and chronic steroid n=5 hu5C8 + chronic MMF and 5 days steroid n=3 hu5C8 + tacrolimus n=3

Costimulation Blockade in Primates T Cell infiltrates in normally functioning renal allografts H&E CD83CD3 H&E Kirk, et al

Anti-CD40L : Le plus efficace CTLA4-Ig : peu efficace en monothérapie Effet inhibiteur des immunosuppresseurs non spécifiques Anti-B7 : pas d ’induction de tolérance Résultats non reproduit pas d ’autres équipes Pas de démonstration claire de l ’induction de tolérance Etude des souris CD28 - Il existe d’autres molécules impliquées dans la costimulation Conclusion : Blocage du cosignal dans le système CD28-B7 ou CD 40L chez le primate

Rôle des molécules ICOS/ICOSL et OX40/0X40L dans la costimulation

Les différents couples ligands récepteurs impliqués dans la costimulation lymphocytaire Molécules de la costimulation sur la CPA Récepteurs lymphocytaires de costimulation Répartition cellulaire Répartition cellulaire Autres noms Noms usuels CD, monocytes, Macrophages, LT Mémoires LB centres germinatifs B7.1 sur CD et LB B7.2 sur CD, LB, monocytes CD, LB, monocytes Induit sur LB et CD par La liaison CD40/CD40L, Cellules endothéliales Transitoirement Sur LT, LB, après activation CD matures Et LB activés LFA3CD58CD2LFA2 LT B7.1CD80 CD28Tp44 LT4 (95%) LT8 (50%) B7.2CD86 ICOSL B7h/B7RP-1 B7-H2ICOS LT activés TNFSF4OX40LCD134 OX40 TNFRSF4 LT4 et LT8 activés CD27L TNFSF7 CD70CD27TNFRSF7 LT et LB 4-1BBL TNFSF9 CD BB TNFRSF9 LT4 et LT8 activés A. Brossay Le courrier de la Transplantation 2001 Vol1 N2 CD40CD40L

Importance of ICOS-B7RP1 costimulation in acute and chronic allograft rejection Modèle de greffe cardiaque chez la souris Augmentation de l’expression d’ICOS dans les cellules lymphocytaires infiltrant le greffon cardiaque lors du rejet aigu. B7RP-1 (ICOS-L) est exprimé dans les cellules dendritiques intracardiaques et les macrophages infiltrants le greffon Anticorps bloquant anti-ICOS prolongent la survie du greffon cardiaque de 7 à 21 jours et entraîne une diminution significative de l’infiltrat intracardiaque Ozkaynak et al 2001 Nat Immunol Vol 2 p

Rôle du signal de costimulation médié par ICOS-B7RP-1 dans le rejet aigu et chronique d’allogreffe Ozkaynak et al 2001 Nat Immunol Vol 2 p Combined targeting of ICOS and CD154 maintained normal histology and prevented development of transplant arteriosclerosis (day 30) Effects of anti-CD154 therapy on intragraft ICOS expression : Perivascular localization of ICOS+ mononuclear cells within allografts from CD154 mAb-treated recipients 30 days after transplant

The role of the ICOS-B7h T cell costimulatory pathway in transplantation immunity Modèle de transplantation cardiaque chez la souris Blocage précoce ICOS (<6j) Vs blocage retardé (4-10j) Receveurs mismatch MHC majeur: le blocage retardé prolonge plus efficacement la survie du greffon par rapport au blocage précoce Receveur mismath MHC mineur: le blocage précoce entraîne une rejet aigu tandis que le blocage retardé prolonge la survie du greffon Le blocage précoce et retardé supprime l’expansion des CD4 alloréactifs Seul le délai retardé supprime l’expansion des cellules CD8 alloréactives. Harada et al 2003 JCI Vol 112 p

Les différents couples ligands récepteurs impliqués dans la costimulation lymphocytaire Molécules de la costimulation sur la CPA Récepteurs lymphocytaires de costimulation Répartition cellulaire Répartition cellulaire Autres noms Noms usuels CD, monocytes, Macrophages, LT Mémoires LB centres germinatifs B7.1 sur CD et LB B7.2 sur CD, LB, monocytes CD, LB, monocytes Induit sur LB et CD par La liaison CD40/CD40L, Cellules endothéliales Transitoirement Sur LT, LB, après activation CD matures Et LB activés LFA3CD58CD2LFA2 LT B7.1CD80 CD28Tp44 LT4 (95%) LT8 (50%) B7.2CD86 ICOSL B7h/B7RP-1 B7-H2ICOS LT activés TNFSF4OX40LCD134 OX40 TNFRSF4 LT4 et LT8 activés CD27L TNFSF7 CD70CD27TNFRSF7 LT et LB 4-1BBL TNFSF9 CD BB TNFRSF9 LT4 et LT8 activés A. Brossay Le courrier de la Transplantation 2001 Vol1 N2 CD40CD40L

Effet des anticorps bloquants sur la greffe de peau allogénique de souris C57BL/6 Demirci et al Journal of Immunology 2004,

Les souris DKO CD28/CD40L peuvent rejeter une greffe de peau, impliquant d’autres molécules de costimulation Les lymphocytes CD4 et CD8 de ces souris peuvent proliférer in vivo en réponse à un alloantigène, et les CD4 sont plus affectés que les CD8 Les molécules de costimulation OX 40 et ICOS apparaissent à la surface des CD4 et des CD8 DKO après activation allogénique Les anticorps bloquant anti OX40 peuvent bloquer la prolifération des CD4 et CD8 DKO, inhiber le rejet d’une greffe de peau allogénique DKO Les anticorps anti OX40 sont capables, en association avec anti40L et antiCD28 d’induire la tolérance à une greffe de peau allogénique OX40 semble être une molécule de costimulation de premier plan dans les stratégies d’induction de tolérance par blocage du cosignal Rôle d’OX40 dans les rejets indépendants de CD28 et CD154 Demirci et al Journal of Immunology 2004,

Questions posées Quels couples de ligand faut-il bloquer ? Avec quelle cinétique, combien de temps? Immunosuppresseurs associer ? Mécanismes d’action ? Effets secondaires ? Thrombose vasculaire avec anti-CD40L, liée aux interactions avec récepteurs plaquettaires Risque de développer une tolérance pour les pathogènes (virus) ? Meilleure association pour blocage du cosignal ? Intérêt des anticorps anti-CD28 qui inhibent le signal 2 en respectant le signal négatif médié par CTLA4 ?

Compared with CTLA4Ig, LEA29Y has: 4-fold higher avidity for CD864-fold higher avidity for CD86 2-fold higher avidity for CD802-fold higher avidity for CD80 ~10-fold more potent inhibition of T-cell activation in-vitro~10-fold more potent inhibition of T-cell activation in-vitro Bélatacept LEA29Y CTLA4Ig re-engineered for transplantation

LEA29Y Phase II dose-finding study design *All patients received MMF, basiliximab, and corticosteroid-tapering regimen Clinical endpoint (LEA29Y arms unblinded) Clinical endpoint Randomization 1 month 3 months6 months1 year 150–400 ng/ml150–300 ng/ml CsA (7±3 mg/kg daily)* LEA29Y* mg/kg mg/kg every 4 or 8 weeks DAY 1 5 ‘LOW’ ‘HIGH’ 10 mg/kg Vincenti NEJM 2005

Biopsy-proven acute rejection Acute rejection (%) Acute Rejection Rates* Biopsy-proven acute rejection/ Presumed acute rejection *Intent-to-treat population LEA29YCsA 19% 18% 22% 19% Mean time to first rejection: LEA29Y (53 days); CsA (52 days) Vincenti NEJM 2005

Post-transplant Renal Function LEA29Y CsA Median calculated creatinine clearance (ml/min/1.73m 2 ) Median Iohexol clearance (ml/min/1.73m 2 ) Iohexol clearance † Calculated glomerular filtration rate †‡ Months post-transplant 136 *p<0.05 compared with CsA; †Median, 25% and 75% percentiles shown; ‡Cockcroft-Gault * n=102n=77n=43n=28 n=132n=60 n=120n=47 n=113 n=43 Vincenti NEJM 2005

Co-stimulation blockade using LEA29Y-based maintenance immunosuppression provides opportunities for reduced toxicities versus CsA Potential for improved long-term renal graft function LEA29Y may represent a new alternative for CNI-free maintenance immunosuppression Conclusion

Une approche d ’avenir pour l ’induction de tolérance Beaucoup de paramètres à préciser avant d ’obtenir le protocole parfait Le blocage de plusieurs signaux de coactivation sera nécessaire, probablement en association avec un immunosuppresseur en début de transplantation Le Bélatacept, premier inhibiteur du signal 2 développé en transplantation clinique est un immunosuppresseur efficace, non néphrotoxique et bien toléré

Le troisième signal de prolifération lymphocytaire

Activation lymphocytaire T rôle des quatre signaux TCR Antigène HLA Classe II Calcineurine NFAT IL2 Signal 1 CD28 B7-1,2 Signal 2 costimulation IL2R IL2 TCGF Signal 3 CD40L CD40

IL2 et prolifération des CTL

Les trois récepteurs de l ’IL2

Schéma général de la transduction du signal dans la famille des récepteurs de l ’IL2

IL2 et transduction du signal IL2R Jak 3 Jak 1 Stat 3 Stat 5 PI-3 Kinase m TOR Cycle cellulaire Grb2 SOS Ras MAP Kinase Jun Fos

Fixation de l’IL-2 sur IL-2R Phosphorylation des Jak et du récepteur Transcription Fas-L + Liaison Fas-L/ Fas Apoptose Phosphorylation de STAT 5 Migration dans le noyau de STAT 5 Y.L Prolifération cellulaire Signal 4 Survie cellulaire Facteur de survie mTOR Signal 3

L’IL-2 : survie, prolifération ou apoptose cellulaires Signal 3 Prolifération Survie cellulaire Apoptose Y.L

Interleukine 2, cible des immunosuppresseurs Inhibiteurs de la calcineurine : –Diminution de la synthèse d ’IL2 –Diminution de la synthèse du récepteur à l ’IL2 Inhibiteurs de mTOR –Inhibition de la transduction du signal induite par l ’IL2 Anticorps anti-récepteurs de l ’IL2 : –Inhibition de la fixation de l ’IL2 à son récepteur Tous ces immunosuppresseurs inhibent in vitro la prolifération lymphocytaire induite par l ’IL2

Redondance de l ’effet de l ’IL2 Tous les immunosuppresseurs actuels inhibent la prolifération lymphocytaire induite par l ’IL2 in vitro (signal 3), et pourtant… –Les souris KO pour l ’IL2 font des rejets de greffe –Les patients dont les récepteurs à l ’IL2 sont bloqués font des rejets de greffe –Les souris KO pour l ’IL2 ou la chaîne  du récepteur à l ’IL2 ont une lymphoprolifération et des anomalies auto-immunes L ’effet de l ’IL2 sur la prolifération lymphocytaire est un effet redondant.

La famille des récepteurs de cytokines cc   cc cc wsxws  Famille des récepteurs de l’IL2 IL3R GM-CSFR IL5R IL6R LIFR OSMR CNTF Système hématopoÏétique EPOR PRLR GHR G-CSFR Systèmes divers cc gp130 IL2RIL4R IL7R IL9R IL15R cc Système lymphoïde IL2R IL15R 

Rôle central de  c dans la réponse immunitaire IL2RIL4RIL7RIL9RIL15R prolifération lymphocytaire différenciation lymphocytaire différenciation et prolifération des cellules tueuses Naturelles Prolifération lymphocytaire prolifération lymphocytaire

Représentation schématique de la chaîne  c motif à cystéines motif ws pseudo-domaine SH2 site de liaison à Jak3 86

IL2R IL4R IL7R IL9R IL15R Jak 3 Jak 1 Stat 6 Stat 3 Stat 5 Stat 3 Stat 5 Stat 3 Stat 5 Stat 3 Stat 5

Rôle non redondant de la chaîne  c dans la réponse immune Déficit immunitaire lié aux mutations de la chaîne  c et de la protéine Jak 3

Le déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X Maladie héréditaire récessive liée au sexe Infections récidivantes à germes opportunistes ou non débutant dès les premiers mois de vie Troubles de croissance staturo-pondérale Fréquence : 1-5 / million de garçons 50% des DICS Mortelle en absence de greffe de moelle Premier traitement par thérapie génique

Le déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X Absence de lymphocytes T matures ou immatures et de cellules tueuses naturelles Nombre normal ou élevé de lymphocytes B Le gène impliqué : code pour la chaîne  c

IL15R  Jak 3 Jak 1 Stat 3 Stat 5 cc IL2/IL15R  IL2R  Jak 3 Jak 1 Stat 3 Stat 5 cc IL2/IL15R  IL2R et IL15 R sur les lymphocytes T et NK IL2 RIL15 R

Expression d ’ IL2R  et IL15R  IL2R  Lymphocytes T et B IL15R  Lymphocytes T activés et B Macrophages Cellules stromales moelle Mastocytes Rein, foie, cœur, muscle, poumon, cellules endothéliales

Rôle de l ’IL15 Développement, survie et fonction des lymphocytes NK Stimulation mastocytes Prolifération lymphocytaire T (redondante avec l ’effet de l ’IL2) Stimule les TH1 Stimule la prolifération des CD8 mémoires Stimule les fonctions effectrices et la prolifération des CD8 Stimule la production d ’anticorps par certains lymphocytes B Lutte contre les infections intracellulaires (monocytaires) Effet inhibiteur de l ’apoptose induite par l ’activation (IL2 dépendante)

Immunomodulation et famille des récepteurs de l ’IL2 Anticorps anti-IL2R  basiliximab et daclizumab Anticorps anti-IL15R  molécule de fusion Anticorps anti-IL2/IL15 R  Anticorps bispécifique : anti-ILR  et anti-IL2/15 R  Rapamycine : Inhibition du signal médié par le récepteur à l ’IL2 et à l ’IL15 Inhibiteurs de JAK 3 sont des immunosuppresseurs en cours de développement

LYMPHOCYTE ACTIVATION SIGNALS: IN VITRO MODEL G1 S G2 M G2 M Ag signal 1 APC T Cell Key Promoters e.g.IL-2, CD40L IL-2 RAFT Purine Synthesis de novo Pathway calcineurine cycline/CDK signal 2 MAP kinases IL- 15, 4, 7, 9, etc Costimulation signal 2a signal 3

Questions In vitro = in vivo ? Rôle de l ’IL2 in vivo ? Effet différentiel sur les CD4 et les CD8 ? Effet de la costimulation sur les CD4 et sur les CD8 ? Effets respectifs de l ’IL2 et de l ’IL15 dans le troisième signal sur les CD4 et les CD8 ? IL15 signal de prolifération et de survie ?

Effets in vivo de l ’IL2 et de l ’IL15 Souris Tg IL2R  -/- : pas de récepteur à l ’IL2 et à l ’IL15 Peuvent avoir une réponse anticorps primaire et secondaire Peuvent rejeter les greffes de peau allogéniques Ont une réponse vaccinale CD8 Ces réponses sont atténuées par rapport aux souris contrôles, suggérant un effet seulement partiel des récepteurs à l ’IL2 et à l ’IL15 dans ces réponses immunes Yu et al 2003 J Immunol Vol 170 p

Costimulation et signal de prolifération modèle in vivo chez la souris Les signaux 1 et 2 sont suffisants à la prolifération des CD4, l ’IL2 n ’intervient pas pour la prolifération, mais pour la survie et pour l ’apoptose. La costimulation CD28/CD40L n ’intervient pas dans l ’activation des CD8. C ’est l ’IL15 qui initie la division cellulaire, puis l ’IL2 produite par les cellules CD4 (coopération cellulaire). Rôle des cytokines de la famille de l ’IL2 La résistance à l ’induction de tolérance par le blocage du cosignal vient des CD8, et est contrôlée par le blocage de IL15R. Intérêt du blocage du signal 2 et du signal 3 Rôle de l’IL15 dans la génération et l’activation des LT mémoires

Mécanismes d’action des immunosuppresseurs

Conclusion Les signaux impliqués dans la costimulation et le troisième signal de prolifération sont redondants Seul le premier signal d’activation n’est pas redondant Le blocage de la costimulation est un des moyens d’obtenir un état de tolérance Les résultats des expériences obtenus in vitro ne sont pas forcément extrapolables à la réalité in vivo Les signaux de costimulation et de prolifération sont la cible d’immunosuppresseurs en cours d’utilisation et en développement