Lymphocytes B M. Alessandra Rosenthal-Allieri Laboratoire Central d’Immunologie Hôpital de l’Archet CHU-Nice

Plan I. Lymphocytes B 1. Immunoglobulines : caractéristiques, génétique 2. BCR 3. Molécules de surface du lymphocyte B II. Différenciation des lymphocytes B 1. Maturation Ag dépendante 2. Maturation Ag indépendant 3. Localisation anatomique III. Lymphocytes B mémoire IV. Sous-populations et pathologie

I. Lymphocytes B - Les lymphocytes B sont le support de l’immunité adaptative humorale par la production d’anticorps spécifiques. - Cette immunité est transférable par le sérum. - Chez l’homme, les lymphocytes B représentent 5 à 15% des lymphocytes sanguins, soit 20 à 400/mm3.

Lymphocytes B Origine : - Bourse de Fabricius (oiseaux) - moelle osseuse (homme) Fonctions : a) l’activation par l’Ag induit leur transformation en plasmocytes (immunoglobulines sécrétées) b) capacité de se comporter en CPAg : peuvent fixer un Ag soluble : -spécifiquement par BCR -non spécifiquement par les récepteurs des complexes immunes pour les parties constantes des IgG ou pour les fragments du C3 puis l’endocyter, le dégrader, le ré-exprimer à la surface, associé aux molécules HLA classe II, et le présenter aux lymphocytes T CD4+

1. Immunoglobulines : caractéristiques 5 isotypes, définis par la nature de la chaîne lourde : IgG (IgG1 à 4) IgM IgA (IgA1 et 2) IgD IgE Bifonctionelles : Extrémité N terminal : • régions charpentes ( framework FR1 à 4) • zones hyper-variables (complementary determining regions = CDR 1 à 3): spécificité Extrémité C terminale : • Fc (fonctions effectrices : capacité à activer le C’, à se lier aux FcR etc.) Répartition : IgM intra-vasculaires IgG sérum et tissus IgA surface muqueuse respiratoire et intestinale IgE liées aux mastocytes et basophiles

1. Immunoglobulines : génétique - 1 Trois complexes génétiques : IgH en 14q32 Igk en 2p12 Igl en 22q11 Chaque complexe se compose de 3 ou 4 régions : V = variables D = diversité J = chaîne J C = constant Lorsque un précurseur lymphoïde s’oriente vers la lignée B, le génome codant pour les chaînes des Ig va subir des réarrangements au hasard : Chaînes lourdes : un gène D va se rapprocher au gène J (DJ), puis le gène VH se rapproche (VDJ) Chaînes légères : seul existe le rapprochement VJ Chaque gène V contribue environ aux premiers 100 Aa du domaine variable, tandis que les segments D et J codent pour les derniers Aa. L’ensemble VDJ constitue le 3ème CDR, composant essentielle de la spécificité Ab

1. Immunoglobulines : génétique - 2 Les réarrangements et l’expression des gènes d’Ig se déroulent selon une cinétique ordonnée et sont contrôles à trois niveaux distincts : lignée cellulaire: Les Ig ne sont exprimées que par les lymphocytes B. stade de la différenciation cellulaire: Les recombinaisons et l'expression des gènes d'Ig sont ordonnées selon le stade du développement de la cellule. Ainsi, les réarrangements et l'expression des gènes du locus IgH précèdent ceux des gènes des chaînes légères. exclusion allélique: Le réarrangement complet sur un des allèles, aboutissant à la formation d'un produit VHDJH ou VLJL codant, entraîne l'inhibition du réarrangement sur l'autre allèle.

Réarrangements des gènes d'immunoglobulines Les régions variables des anticorps sont codées par l'association d'un segment V, d'un segment D pour les chaînes lourdes, et d'un segment J, par un mécanisme appelé “recombinaison V(D)J”. Le grand nombre de segments V, D et J disponibles, les multiples combinaisons entre ces éléments (diversité combinatoire) ainsi que l'imprécision de leurs jonctions (diversité jonctionnnelle) contribuent considérablement à la diversité des anticorps.        Les recombinaisons entre les différents segments V des gènes des chaînes lourdes et légères s'effectuent à des sites spécifiques nommés RSS (séquence signal de recombinaison), disposées de façon à ce que les recombinaisons ne puissent se faire qu'entre segments D et J puis V et D pour les chaînes lourdes, et qu'entre V et J pour les chaînes légères.       Les recombinaisons V(D)J mettent en jeu une machinerie enzymatique composée des protéines RAG-1 et RAG-2 (pour “Recombinaison Activating Gene”) exprimées exclusivement dans les lymphocytes B et T au stade du développement où les gènes des récepteurs antigéniques sont réarrangés.        Recombinaison en deux phases: 1. les protéines RAG-1 et RAG-2 reconnaissent et assemblent en un “complexe synaptique” les RSS asymétriques de deux segments de gènes, puis induisent une cassure double brin de l'ADN. Chaque clivage conduit à la production d'une extrémité franche au niveau des RSS et d'une structure intermédiaire en “épingle à cheveu” au niveau de la séquence codante. 2. les cassures sont identifiées, traitées et réarrangées par la machinerie ubiquitaire de réparation de l'ADN. De manière générale, les extrémités codantes sont rapidement assemblées en jonctions codantes avec ouverture de la structure en épingle et des modifications favorisant la diversité des récepteurs antigéniques par l'addition et/ou la délétion de nucléotides par la déoxynucléotidyl terminale transférase (TdT). La TdT est exprimée précocement dans la différenciation B, au stade pro-B, lors des réarrangements des gènes du locus IgH.     Si un cadre de lecture ouvert est obtenu, l'exon variable V(D)J ainsi formé sera transcrit. L'ARN sera ensuite épissé puis traduit pour permettre la synthèse d'une chaîne lourde ou légère.

La réaction de recombinaison V(D)J se produit en deux phases distinctes.

2. Le BCR Lymphocytes B : les seules cellules à porter sur leur surface des IgS (environ 100 000/cellule) IgS : récepteur spécifique pour l’Ag, synthétisé et exprimé avant toute rencontre avec l’Ag Chaque lymphocyte B n’est porteur que d’un seul isotype k ou l (2/3 k, 1/3 l) et la forme dimérique de la chaîne µ, souvent associées aux chaînes d : phénotype IgM+ IgD+ = cellule matures. Isotypes g, a et e sont < 1% dans le sang, mais IgA surtout dans le tissu lymphoïde associé aux muqueuses IgS : même structure que l’Ig sécrétée avec modification de l’extrémité C’ des chaînes lourdes pour leur encrage sur la membrane Le BCR est étroitement associé à un complexe multi-moléculaire pour la transduction du signal d’activation : dimères Iga (CD79a) Igb (CD79b), analogues fonctionnels du CD3 dans le T

3. Molécules de surface du lymphocyte B 1) Marqueurs de la lignée B (panB) CD19, CD20, CD22, CD24 CD19: phosphoprotéine, forme des complexes avec CD21 et CD81 (TAPA). Stabilise le BCR à tous les stades (➨ plasmocytes) CD20: molécule de canal calcique, apparaît sur les cellules matures CD22: impliqué dans le signal de transduction du BCR CD10: endopeptidase neutre (CALLA : common acute lymphoid leukemia antigen) présent à la fois aux stades précoces de la lymphopoïèse B et sur les B matures activés intra-folliculaires 2) Complexe CD19-CD21-CD81 CD21 récepteur pour C3d du complément : lorsque un Ag active le système complémentaire avec production de C3d, il se produit un co-engagement des IgS et de CD21, induisant leur rapprochement sur la membrane. CD21 est étroitement lié à CD19, dont la queue intra-cytoplasmique liée à la tyrosine kinase lyn provoque des activation moléculaires en cascade (signalling)

3) CD32 (RFcgIIB) : Fonctions différentes du RFcgII A et B ( 2 gènes producteurs) RFcgIIA sur phagocytes -déclenche l’endocytose des particules revêtues d’Ag -possède dans sa queue cytoplasmique une séquence ITAM-like phosphorylable et capable d’initier une cascade activatrice Syk dépendante, activant la phagocytose et la sécrétion de cytokines inflammatoires RFcgIIB sur phagocytes, mastocytes, lympho B -pas de phagocytose, mais rétrocontrôle de la synthèse d’Ac. -séquence ITIM intra-cytoplasmique activant une tyrosine-phosphatase (SHIP) dont l’activation va inhiber diverses fonctions cellulaires ➨ Lorsque un complexe Ag/Ac provoque un co-engagement des IgS et des RFcgIIB il y a potentialisation de l’activation lymphocytarie mais aussi retro-contrôle de la synthèse d’Ac par des Ac de même spécificité, pour éviter des recrutements cellulaires inutiles. De même, lorsque des complexes immuns à IgG sollicitent simultanément le RFcgIIA et le RFcgIIB sur les macrophages, le résultat net est l’inhibition de la phagocytose (PTI et IgG IV)

4) CD40 Internalisation Ag Reconnaissance de l’Ag Ré-expression des peptides Ag à la surface en association à HLA classe II Présentation aux lymphocyte T : dialogue T-B BCR L’oligomérisation du TCR induit l’expression du CD40 ligand (CD40L ou CD154) sur le T qui en s’associant à son contre récepteur CD40, constitutivement exprimé sur les B, représente un puissant signal de : - prolifération et de prévention d’apoptose - de commutation isotypique L’activation de CD40 provoque l’apparition de CD86 et ensuite de CD80 sur le B, récepteurs de CD28 sur le lymphocyte T : amplification de la réponse cytokinique du T, production de cytokines favorisant la différentiation des B et la production d’Ac.

II. La différentiation des lymphocytes B 2 grandes phases dans l’ontogénie B : 1) antigène indépendante -a lieu dans l’organe lymphoïde primaire -conduit à la formation de ly B matures naïfs -élimine les ly B autoréactifs: établissement de la tolérance 2) antigène dépendante -Formation des cellules effectrices Différenciation Maturation Production d’Ac Lympho B mémoire

Cellules matures exprimant le BCR 1. Maturation antigène indépendante Moelle osseuse Foie foetal IL7 Stem cell factor À partir des cellules CD34+ CD19+ CD24+ CD10+ CD20+ CD22+ Cellules matures exprimant le BCR Quittent la moelle pour aller dans les organes lymphoïdes périphériques

1. Maturation antigène indépendante Etape indépendent de l’Ag : 4 stades de différentiation correlés avec le réarragenements des gènes des Ig et l’expression d’autres molecules de surface: 1. Cellules pro-B (progéniteurs B) 2. Cellules pré-B (précurseurs B) 3. Cellules B immatures 4. Cellules B matures

µ

1. Maturation antigène indépendante en fonction de l’expression des molécules de surface Les molécules qui caractérisent la lignée B apparaissent progressivement et permettent de définir chaque étape de maturation: Molécules de surface exprimées B1 pro-B CD19, CD22, CD79b B2 pré-B CD10 B3 immature C µ cytopl. B4 mature +/-CD10 IgM de surface NB. Sur la base de l’expression des molécules de surface lors du développement de la lignée B, il est possible de classer les lymphoproliférations aigues de type B (LAL-B)

Cellule B mature naïve BCR : IgM+ et IgD+ Circule en permanence entre les différents organes lymphoïdes secondaires à la rencontre de l’Ag spécifique Demi-vie courte en absence de rencontre de l’Ag spécifique : 3 jours Si la rencontre avec l’Ag spécifique a lieu, on passe à la 2ème étape de développement dépendante de l’Ag

2. Maturation antigène dépendante A lieu au niveau des organes lymphoïdes secondaires périphérique (ganglions, rate, MALT) Les organes lymphoïdes secondaires ont une architecture hautement organisée avec des zones B, les follicules, et des zones T - lieu de rencontre entre le Ly B et l’Ag spécifique - lieu de la commutation isotypique - lieu d’hypermutation somatique avec sélection positive des ly B dont le BCR présente une maturation d’affinité pour l’Ag

2. Maturation antigène dépendante Reconnaissance spécifique de l’Ag par le BCR : événement central nécessaire mais non suffisant à l’activation : 1er signal La coopération du ly B avec le ly T CD4+TH2 spécifique du même Ag est nécessaire à la différenciation en LyB effecteur : 2è signal Cette collaboration B-TCD4+TH2 fait intervenir des - protéines de surface : CD40 du ly B avec CD40L du ly T - cytokines secrétées: IL4, IL5, IL6, IL10

…suite La collaboration B/T va d’abord déclencher la division de la cellule B Une petite partie va se transformer rapidement en plasmocytes sécréteurs d’Ac de faible affinité Une grande partie de ces cellules B vont constituer le centre germinatif des follicules lymphoïdes avec : commutation isotypique (switch) de la chaîne lourde de l’Ig: mécanisme changeant la classe de l’Ig et ainsi permettant d’associer à une même fonction Ac des fonctions effectrices différentes hypermutation somatique : processus qui introduit des mutations ponctuelles dans les régions V réarrangées de l’Ig et par conséquent peuvent modifier l’affinité de liaison à l’Ag. Les ly B dont le BCR présente une maturation d’affinité pour l’Ag seront sélectionnées positivement et poursuivent leurs différenciation en: Plasmocytes sécréteurs d’Ac Cellules mémoire qui permettent une réponse secondaire plus rapide, plus intense et plus efficace (intérêt des rappels au cours des vaccinations).

Ganglion 3. Prolifération et différenciation B 2. Activation B 1. Activation initial T et B 4. Sécrétion d’Ac par plasmocytes

2. Maturation antigène dépendante : sélection Dans les follicules lymphoïdes les B deviennent des cellules matures primaires capables de répondre à l’Ag. En l’absence d’Ag : mort par apoptose après quelques semaines. Contrairement au répertoire du T mature à la sortie du thymus, celui des lymphocytes B primaires est poly-réactif et auto-réactif : la sélection se fait au sein des centres germinatifs des follicules lymphoïdes avec mise en place d’un répertoire spécifique et sans auto-réactivité. Les follicules lymphoïdes primaires sont constitué d’un dense réseau de cellules dendritiques folliculaires qui présentent les Ag aux B. Les lymphocytes B activés par le BCR et aidés par les lymphocytes T via le couple CD40/CD40L, après une phase d’expansion clonale, deviendront des plasmocytes secrétant des IgM.

Organes lymphoïdes secondaires Follicules lymphoïdes primaires L’accès à cette « niche de survie » est soumis à compétition et les lymphocytes B immatures auto-réactifs ayant rencontré l’Ag ne peuvent y pénétrer et meurent par apoptose en 72h (phénomène lié à la perte de récepteurs des chimiokines impliqués dans cette migration) Mécanisme de contrôle qui « purge »  le système immunitaire des lymphocytes B possédant une forte affinité pour les autoAg : clones potentiellement dangereux

2) Maturation antigène dépendante - suite Après initiation de la réponse dans la zone T, quelques rares cellules B gagnent les follicules primaires pour donner naissance aux centres germinatifs où ont lieu : - Expansion clonale d’un nombre initial très limités de B - Hypermutations somatiques ponctuelles des régions variables des chaînes H et L - Sélection positive des B spécifiques de l’Ag - Différenciation en plasmocytes ou lymphocytes B mémoire

2) Maturation antigène dépendante : follicules Les lymphocytes B activés entrent dans le follicule lymphoïde et se multiplient, puis se regroupent dans la zone sombre du centre germinatif: ils sont appelés centroblastes (IgM-, CD5-, CD38+). Les petits lymphocytes recirculants sont refoulés en périphérie et forment la zone du manteau (IgM+, IgD+, CD5+). En se divisant, les centroblastes: accumulent de nombreuses mutations somatiques qui modifient l’affinité de l’Ig modifient la spécificité isotypique (commutations de classe) des Ig synthetisées. Les lymphocytes se transforment en centrocytes, migrant dans le zone claire du centre germinatif : re-expression de IgS. Les CDF présentent des antigènes natifs à leur surface. La reconnaissance de l’Ag induit pour le centrocyte un signal de survie, tandis que les cellules B ayant une affinité insuffisante pour l’Ag subissent l’apoptose (coopération T-B via CD40/CD40L). Rôle des cytokines dans ces phénomènes (ex. IL-4 = IgE, TGFb = IgA)

III. Lymphocytes B mémoire Lymphocytes impliqués dans la réponse immunitaire secondaire, par opposition aux lymphocytes vierges de la réponse primaire Les cellules mémoire sont quiescents, en phase G0 et présentent des caractéristiques différentes des cellules naïves : - durée de vie plus longue - nombre d’IgS plus faible, mais de meilleure affinité pour l’Ag L’Ag ne se fixera que sur les cellules possédant un récepteur de haute affinité Ceci sélectionne les clones capables de produire des IgS de haute affinité pour l’Ag Ces cellules présentent les Ag CMH classe II fortement exprimés et la molécule de surface CD27

IV. Sous-populations 4 sous-populations de cellules B: IgD+ CD38- B naïves IgD+ CD38+ B pré-CG IgD- CD38+ B CG IgD- CD38- mémoire Cytometrie en flux Sang, Amygdale

Si on rajoute d’autres marqueurs (IgM et CD27): IgM+ IgD+ CD38- CD27- B naïves IgM+ IgD- CD38- CD27+ B mémoire IgM+ IgD+ CD38+ CD27- pré-CG IgM+ IgD- CD38++ CD27+ plasmablastes Sous-populations B

Sous-populations lymphocytaires B et pathologies associées

Destin des cellules B médullaires Cellules B médullaires : quittent la moelle, circulent et se différencient dans les organes lymphoïdes secondaires en cellules folliculaires et cellules de la zone marginale Cellules folliculaires : réponse T-dépendantes aux Ag protéiques, mais aussi re-circulent dans la moelle osseuse (autour des sinusoïdes) où peuvent répondre de façon T-indépendante Cellules folliculaires de type I IgDhi IgMlow CD21mid Cellules folliculaires de type II IgDhi IgMhi CD21mid Cellules de la zone marginale: cellules B naïves qui ont un phénotype de cellules pré-activées, une capacité d’auto-renouvellement et une longue durée de vie. Le CD21 est exprimé sur les cellules da la zone marginale >> que sur les cellules folliculaires.

Dans la moelle osseuse sont produites les cellules B immatures Dans la moelle osseuse sont produites les cellules B immatures. Une grande partie de ces cellules est auto-réactive et est éliminée par «receptor editing» ou anergie clonale. Les cellules qui ont complété le réarrangement des gènes des Ig et qui ne sont pas ou peu auto-réactives peuvent maturer vers les stades de cellules B transitionnelles T1 et T2 et vers le versant folliculaire ou marginal B-T1dans la moelle et la rate, doivent acquérir le capacité di re-circulation B-T2: ont encore des marqueurs d’immaturité, mais sont rentrées dans le follicule, ont acquis l’expression de IgD et CD23 et la capacité de re-circuler L’orientation folliculaire/marginale dépend du signaling du BCR, Notch2, NF-kB et des molécules d’adhésion/chimiokines présentes BCR: Fort signaling ➨ cellules folliculaires Faible signaling ➨ cellules de la zone marginale Ex. maladie de Bruton, déficit en BTK en aval de BCR et défaut en cellules folliculaires de type I

Signaux nécessaires pour déterminer l’engagement des cellules B vers le follicule ou la zone marginale Cellules folliculaire Cellules de la zone marginale