CENTROMERES M1: Cytogénétique germinale et somatique Faculté de Médecine de Nice 12 novembre 2009 Florence Pedeutour

Centromère : définition morphologique Constriction primaire : zone d’attachement des deux chromatides sœurs visible du stade de prophase à celui de métaphase : apparaît comme une région de rétrécissement au niveau de laquelle les 2 chromatides ne sont pas séparées Microscopie électronique Bandes RHG

Pour établir le caryotype, les chromosomes sont classés selon : -1) leur taille, -2) la position du centromère par rapport aux extrémités (indice centromérique) entre le bras court « p » et le bras long « q » -3) le marquage des bandes chromatidiennes Classification des chromosomes selon la position du centromère acrocentrique (p<<q) ( = télocentrique ) médian ou métacentrique (p=q) submétacentrique ou submédian (p<q) (ou subtelocentrique) p q télomère centromère Définition morphologique : centromères et caryotype

Caryotype humain féminin normal ; bandes GTG acrocentriques métacentrique submétacentriques métacentrique submétacentriques

Caryotype tumoral anormal ; bandes RHG

Centromère : définition fonctionnelle Fin de prophase : contraction des chromosomes (condensation chromosomique), disparition de l’enveloppe nucléaire Métaphase : apparition du fuseau mitotique sous forme de longues fibres de tubuline irradiant à partir de 2 structures polaires, les centrioles. Il y a alors accrochage des chromosomes au niveau du centromère à l’un des éléments du fuseau mitotique : les fibres des kinétochores centrioles Centromère : site d’attachement des chromatides aux kinétochores Division cellulaire : les microtubules vont se rétracter en attirant chacune des chromatides sœurs vers un pôle opposé CENTROMERE : STRUCTURE INDISPENSABLE POUR LA REPARTITION EQUITABLE DU MATERIEL GENETIQUE LORS DE LA DIVISION CELLULAIRE CHEZ LES EUCARYOTES

Le centromère est une association d’ADN centromèrique et d’un complexe protéïque formant le kinétochore Kinétochore : Complexe multiprotéique de grande taille Structure plane trilamellaire disposée sur la face latérale de chaque chromatide au niveau du centromère couche interne : nm couche médiane: nm couche externe : nm

ADN centromérique : hétérochromatine constitutive Chez l’homme : formé essentiellement d’ADN « alpha-satellite » ADN alpha-satellite : présent dans la région centromérique de tous les chromosomes humains Composé de séquences « alphoïdes » ADN fortement répété (milliers de répétitions d’un motif identique) Il s’agit de la répétition sur une longueur de 300 kilobases (pour le chromosome Y) à plus de 5000 kilobases d’un motif de 171 paires de bases (monomères), organisés en tandem Les monomères sont organisés en « unités » qui comportent un nombre variable de monomères selon les chromosomes Il existe des différences de séquences des monomères d’un chromosome à l’autre ADN CENTROMERIQUE

Pas de séquence d’ADN consensus centromérique (à la différence des séquences télomériques) : Variation de séquence d’une espèce à l’autre Dans une même espèce : variation de séquence d’un chromosome à l’autre Pourtant la fonction centromérique est vitale, universelle et conservée chez tous les eucaryotes PARADOXE A ce jour, à l’exception de la levure S. cerevisiae, on ne connaît pas avec certitude quelle est la séquence exacte d’ADN se liant au kinétochore. Chez l’homme, elle est préférentiellement située au sein des séquences alpha-satellites

On peut mettre à profit la structure répétitive de l’hétérochromatine centromérique en l’identifiant par un marquage spécifique des séquences alpha-satellites: Le marquage des « bandes C » Utile pour vérifier : -la position d’un centromère -le nombre de centromères sur un chromosome (ex: chromosomes dicentriques) Marquage CBG C-hydroxyde de Barium-Giemsa Attention! Le marquage C colore aussi -l’ADN alpha-satellite du bras long du chromosome Y -l’hétérochromatine péricentromérique (1q, 9q, 16q…) Y

On peut aussi mettre à profit l’existence de différences de séquences des monomères d’un chromosome à l’autre en utilisant des sondes fluorescentes centromériques spécifiques d’un chromosome donné (FISH avec sondes alpha-satellites centromériques) Sonde alpha-satellite chromosome 11 Intérêt : -Identifier l’origine d’un chromosome anormal -Comptage rapide (criblage d’une anomalie de nombre) -Identification de chromosomes dicentriques Sonde alpha-satellite centromérique chromosome 12

LES PROTEINES CENTROMERIQUES On distingue : -Les protéines constitutives qui restent au niveau du centromère tout au long du cycle cellulaire Les + importantes : CENP-A (couche interne) CENP-B (liaison à l’ADN apha-satellite) CENP-C (couche interne) CENP-H CENP-I -Les protéines passagères qui se fixent transitoirement lors de la mitose exemple : CENP-E (couche externe)

CHOMOSOMES ACENTRIQUES Chromosomes dépourvus de centromères Bandes C négatifs Alpha-satellites négatifs Absence de liaison au microtubules Très instables, rapidement perdus lors des divisions cellulaires (voir mécanisme des délétions : module 2) Exemple type : chromosomes double minutes (abordés dans le module 3)

CHROMOSOMES DICENTRIQUES Ces chromosomes résultent de la fusion, de deux chromosomes homologues ou non homologues. Apparence de deux constrictions primaires et 2 sites de marquage bandes C + Les chromosomes dicentriques sont habituellement très instables (sauf si les deux centromères sont très proches) car chacun des centromères peut être attiré vers les pôles opposés de la cellule : cassures inégales des chromatides, formation d’anomalies de structure …..

CHROMOSOMES PSEUDODICENTRIQUES Lorsque les deux centromères sont suffisamment éloignés, l'un d'entre eux perd sa fonction, formant un pseudodicentrique stable. Les deux centromères contiennent bien l’ADN alpha-satellite et présentent un marquage positif en bandes-C, et sondes FISH alpha-satellites, mais un des deux centromères est inactivé : le complexe protéïque y est incomplet et inactif Le phénomène de « centromérisation-inactivation » du centromère est un phénomène dynamique régulé par des mécanismes épigénétiques (méthylations…) CENTROMERE INACTIF ADN alpha-satellite non fonctionnel

NEOCENTROMERES Dans des cas très rares : chromosomes bandes C négatifs, alpha-satellites négatifs (=chromosomes « analphoïdes ») mais pourvus d’un centromère fonctionnel et actif Une soixantaine de cas décrits en pathologie constitutionnelle Rares cas décrits en pathologie tumorale (notamment liposarcomes) On ne connaît pas la séquence d’ADN se liant au kinétochore Intérêt+++ : modèle d’étude de la fonction centromérique

TELOMERES M1: Cytogénétique germinale et somatique Faculté de Médecine de Nice 12 novembre 2009 Florence Pedeutour

TELOMERES p q télomère centromère Les chromosomes des eucaryotes sont linéaires Chaque extrémité est « coiffée » par une région spécialisée : le télomère Les télomères stabilisent les chromosomes à leurs extrémités, en formant une boucle Les télomères sont cruciaux pour la vie de la cellule : ils empêchent les extrémités des chromatides de fusionner accidentellement (et donc d’engendrer la formation de chromosomes dicentriques et une instabilité chromosomique) Télomère : structure particulière située aux extrémités des chromosomes Mise en évidence : bandes T, FISH avec sondes télomériques

5'...TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..3' 3'.AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC..5' Les télomères humains sont constitués de la répétition d’environ 2000 fois de la séquence 5' TTAGGG 3' STRUCTURE DU TELOMERE Séquences « télomériques » Séquences voisines, associées au télomères Dans les 6 à 10 kilobases situées aux extrémités d’un chromosome, on distingue : Séquences ARS : « autonomous replicating sequences » Séquence riche en bases G sur le brin 5’-3’ Important pour la protection des télomères en permettant la formation d’une boucle de duplex Séquence très conservée dans les différentes espèces Séquence non codante

Mécanisme de la synthèse télomérique : complexe (Normalement : réplication toujours dans le sens 5’-3’ avec perte 8 à 12 nucléotides aux extrémités-Pour les télomères, il faut donc un mécanisme de compensation, sinon raccourcissement à chaque division cellulaire) Effectué grâce à une enzyme : la télomérase Il s’agit d’une enzyme ribonucléoprotéine : transcriptase inverse modifiée composée d’une protéine (hTERT) et d’environ 450 nucléotides d’ARN (hTR). La séquence d’ARN s’apparie en partie avec les séquences répétées terminales (homologie de séquence) Elle permet de jouer le rôle de matrice pour la synthèse de l’extrémité 3’ La télomérase catalyse l’addition des répétitions télomériques aux extrémités des chromosomes Chez les vertébrés : la télomérase est exprimée uniquement dans les cellules germinales, les tissus embryonnaires, les cellules souches des tissus en régénération …et les cellules cancéreuses Tissus somatiques normaux: pas d’activité télomérase Diminution de la longueur des télomères à chaque division cellulaire : liée au vieillissement et à la mort cellulaire

TELOMERES ET CANCER Deux phénomènes distincts : 1.Maintien de la longueur des télomères : confère « l’immortalité » aux cellules cancéreuses a- par expression anormale de la télomérase (80% des cancers) La plupart des cellules cancéreuses ont réacquis la capacité de synthèse de la télomérase : pas de raccourcissement – participent à l’immortalisation des cellules cancéreuses Mesure de l’activité télomérase : domaine de recherche important en oncologie (Q-FISH, RT-PCR, immunohistochimie…) Recherche sur traitements anti-télomérase (anticorps anti-télomérase, vaccination, telomestatin…) b-par mécanisme « ALT »(« alternative lengthening »: allongement alternatif) Dans 20% des cancers dont les sarcomes et les astrocytomes 2. Associations télomériques et instabilité chromosomique Associations télomériques +++ dans certaines tumeurs ou syndromes de prédisposition au cancer, cause d’instabilité Apparition d’anomalies chromosomiques

REMANIEMENTS CONSTITUTIONNELS DES REGIONS SUBTELOMERIQUES Régions chromosomiques subtélomériques : propices aux remaniements Chromosomiques Souvent cryptique Cause d’environ 5% des retards mentaux Recherche d’anomalies subtélomériques dans les retards mentaux inexpliqués (caryotype apparemment normal) FISH « tous télomères » Biopuces ADN (array-CGH) Bien distinguer les vraies anomalies et les polymorphismes et (variations individuelles non pathologiques)