Caractérisation d’une mutation hétérozygote de novo dans le gène ADGRL2 à l’origine d’une microlissencéphalie, d’un rhombencéphalosynapsis et d’un retard de croissance Pascale Saugier-Veber Inserm U1079, Centre Normand de Génomique Médicale et Médecine Personnalisée - Département de Génétique, CHU de Rouen

Association rhombencéphalosynapsis + microlissencéphalie : suspicion d’un défaut pendant la 5 ème semaine de développement 1- L’association RES + microlissencéphalie n’a jamais été décrite 2- Les lésions permettent de dater l’anomalie : 5 ème semaine de développement 3- Les bases moléculaires des RES non syndromiques sont inconnues IMG 26 SA Fœtus témoin 26 SA

L E L H H [[ [[[ [[[[[ [[[ [ [ L E H/L H H L E L H H Cas index Mère Père c.3785T>A p.Leu1262His (het) D Identification d’une mutation de novo faux-sens dans le gène ADGRL2 c.3785T>A; p.Leu1262His Latrophiline 2 Pathogénicité OutilPrédictionScore PROVEANdélétère-3,76 Polyphen2tolérée0,079 SIFTdélétère0,048 MutationTasterdélétère0,999 Ichtchenko et al., J Biol Chem 1999

Le gène ADGRL2 code pour la latrophiline 2, une GPCR qui appartient à la sous-classe des GPCR d’adhésion GPCR d’adhésion Ichtchenko et al., J Biol Chem 1999 ; D’après Hamann et al., Pharmacol Rev ; de Wit et Ghosh, Trends Neurosci Ligand exogène : α-latrotoxine Latrophiline 1 ADGRL1 Latrophiline 2 ADGRL2 Latrophiline 3 ADGRL3

Le gène ADGRL2 est-il impliqué dans d’autres formes de rhombencéphalosynapsis ? Sévérité Hypothèse : Extrémité d’un spectre phénotypique s’étendant jusqu’au rhombencéphalosynapsis RES Sévérité Arrêt de développement précoce Séquençage Sanger des 20 exons du gène ADGRL2 chez 29 patients atteints de rhombencéphalosynapsis associé à : soit un mésencéphalosynapsis soit un diencéphalosynapsis soit une holoprosencéphalie soit un défaut de fermeture du tube neural Absence d’autre mutation du gène ADGRL2 Les mutations du gène ADGRL2 ne représentent pas une cause fréquente de rhombencéphalosynapsis Pasquier et al., Acta Neuropathol 2009

Le gène ADGRL2 est exprimé pendant le développement chez le poulet et la souris Chez le poulet et la souris, Adgrl2 est exprimé tout le long du tube neural, en particulier dans les zones germinatives des vésicules prosencéphaliques dans le mésencéphale et au niveau du 1 er rhombomère dans la région qui donnera le futur cervelet. Chez l’homme, ADGRL2 a un pattern d’expression tout-à-fait similaire pouletsouris

L’α-latrotoxine induit une augmentation du taux de calcium intracellulaire par deux mécanismes distincts Mécanisme actif Transduction de signal couplé aux protéines G Mécanisme passif Formation de pores dans la mb plasmique α-latrotoxine dimères tête α-latrotoxine tétramères aile corps Pore Ca 2+ D’après Rohou et al., Toxicon, 2006 intracellulaire extracellulaire intracellulaire extracellulaire

La libération du calcium intra-cellulaire en réponse à la fixation du ligand est altérée dans les cellules amniotiques ADGRL2:c.3785T>A ; p.Leu1262His Time (min) F-12 EDTA Intensité de fluorescence (340/380) Wt Mt F-12 α-latrotoxine Temps (minutes) 6 AUC (AU) * Wt Mt Phase précoce AUC (AU) Phase tardive

6 Temps (minutes) Intensité de fluorescence (340/380) Wt Wt + U73122 F-12 EDTA F-12 α-latrotoxine Ca 2+ i Ca 2+ e AUC (AU) * ** Wt Mt Wt + U73122 Phase précoce = transduction signal Phase tardive = transduction signal + pores membranaires α-latrotoxine dimères U73122 ADGRL2 conduit à la libération de Ca 2+ i par activation de protéines G et de la phospholipase C La mutation ADGRL2 : c.3735T>A altère la transduction du signal Intensité de fluorescence (340/380) Wt Mt α-latrotoxine 6 Ca 2+ i Ca 2+ e F-12 EDTAF-12

ADGRL2 p.L1262H augmente les propriétés adhésives des cellules HeLa qui l’expriment Surface (AU) A. medium +U latrotoxin pcDNA-vide pcD-ADGRL2-2-Wt pcD-ADGRL2-2-Mt Milieu agrégation A. medium

pcDNA vide pcD-ADGRL2-Wt pcD-ADGRL2-Mt T = 0h T = 72h Taille cicatrice (%) Temps pcD-ADGRL2-Wt pcD-ADGRL2-Mt pcDNA-vide **** *** * Vs ADGRL2 Wt **** ** ADGRL2 p.L1262H réduit la mobilité des cellules HeLa qui l’expriment

pcDNA vide pcD-ADGRL2-Wt pcD-ADGRL2-Mt T = 0h T = 72h Taille cicatrice (%) Temps pcD-ADGRL2-Wt pcD-ADGRL2-Mt pcDNA-vide **** *** * Vs ADGRL2 Wt **** ** ADGRL2 p.L1262H réduit la mobilité des cellules HeLa qui l’expriment % cellules G2-S

L’index de prolifération cellulaire n’est pas altéré dans les éminences ganglionnaires du propositus % cellules G2-S % de cellules en G2-S

Les cellules HeLa qui expriment ADGRL2 p.L1262H présentent des altérations du cytosquelette 5 µm pCD-ADGRL2-Wt pCD-ADGRL2-Mt D’après Le Clainche et al., Physiol Rev 2008

Mécanisme d’action de la mutation ADGRL2:c.3785T>A Modification du cytosquelette d’actine Augmentation de l’adhésion cellulaire Diminution de la libération de Ca 2+ i Mutation faux-sens cytosquelette adhésion Réduction de la vitesse de migration cellulaire α-latrotoxine dimères migration Altération du signal couplé aux protéines G

Souris Adgrl2 -/- : létalité embryonnaire Souris Adgrl2 +/- : hypoplasie du mésencéphale Adgrl2 +/+ Adgrl2 +/- Adgrl2 -/- E15 Diamètre occipito -frontal 8,1 mm 7,2 mm / Distance pôle occipital -colliculi supérieurs 0,4 mm 1,2 mm /

L’excès d’adhésion cellulaire constitue un nouveau mécanisme à l’origine de microcéphalies Microcéphalies non syndromiques : Pas de malformation viscérale associée CGH array normale Microcéphalies/microlissencéphalies isolées MCPH1 CDK5RAP2 CASC5 ASPM CENPJ CDK6 WDR62 STIL CEP135 CEP152 ZNF335 PHC1 CENPE NDE1 TUBA1A TUBB2B TUBB3 TUBB5 TUBG1 Tronc cérébral Tubulinopathies rhombencéphalosynapsis ADGRL2 Orientation du fuseau mitotiqueMicrotubulesLibération du Ca 2+ i  production des progéniteurs neuronaux Altération dynamique des microtubules Anomalies adhésion et migration cellulaires Microcéphalies/microlissencéphalies associées à d’autres malf cérébrales

Rôle de ADGRL2 dans la polarité antéro-postérieure ? Embryon humain de 8 semaines Louvi et al., Development 2003; Sgaier et al., Neuron 2005; Langenhan et al., Dev Cell 2009; Muller et al., PLOS Genet 2015 Lat-1, orthologue des latrophilines chez C. elegans : rôle dans la spécification de la polarité antéro-postérieure Hypothèse que la perte de la polarité antéro-postérieure soit à l’origine de l’agénésie vermienne observée dans le rhombencéphalosynapsis

Rouen Valérie Dupé Laurent Pasquier Leslie Ratié Sylvie Odent Véronique David Matthieu Lecuyer Annie Laquerrière Bruno J Gonzalez Myriam Vezain Thierry Frébourg Rennes Inserm U1079 ERI 28UMR 6290