Métabolisme phosphocalcique normal et rein (calcium, magnésium, phosphates) INSERM U907 CHU Pasteur, Néphrologie

Na + K+K+ K+K+ Urine Cellule Sang 10 mV + 2Cl - K + K+K+ NKCC2 Furosémide ROMK H2OH2O ATP Na + 2 Cl - H2OH2O H2OH2O Ca ++ Mg ++ CLC Inhibition de la réabsorption de NaCl par l’hypercalcémie - D’après M Paillard G-Pt Ca ++ AMPc

Syndromes de Bartter : autosomique récessif, 5 sous-types 1.NKCC2 : cotransport Na-K-2Cl 2.ROMK1 : canal K apical 3.ClCNKB : canal Cl basolateral 4.BSND : sous unité reg ClCKb (avec surdité) 5.Mutation activatrice du CaSR Syndromes de Bartter Pertes rénales de Ca associées à une perte de NaCl Cible : anse large de Henle Phénotype : reproduit la prise chronique de furosémide Polyurie, défaut de concentration des urines, hypokaliémie, hypercalciurie (néphrocalcinose), hypomagnésémie (30 %)

Le magnésium Rôle comme co-facteur enzymatique et dans la stabilité du potentiel de membrane

Répartition du Mg dans l’organisme (PM 24.5)

Réabsorption tubulaire segmentaire du magnésium

Régulation de la magnésémie  Réabsorption rénale  Réabsorption rénale hypomagnésémiehypermagnésémie  Volume extra-cellulaire  Volume extra-cellulaire Furosémide, thiazideamiloride

Hypomagnésémie hypercalciurie familiale Mutation de la paracelline

Hypomagnésémie, hypercalciurie familiale Simon et al Science 1999;285:

Paracelline – : découverte de mutations de PCLN-1 dans l’hypomagnésémie hypercalciurie familiale Autosomique récessif : Hypomagnésémie et hypercalciurie avec néphrocalcinose précoce Simon et al Science 1999;285:

Les jonctions inter-cellulaires dans l’anse de Henle

Paracelline –1 Simon et al. Science 1999;285: Occludine Paracelline-1Colocalisation

Na + K+K+ K+K+ Urine Cellule Sang 10 mV + 2Cl - K + K+K+ NKCC2 Furosémide ROMK H2OH2O ATP Na + 2 Cl - H2OH2O H2OH2O Ca ++ Mg ++ CLC Inhibition de la réabsorption de Mg par mutation de la paracelline - D’après M Paillard G-Pt Mg ++, Ca ++

Blanchard, KI, 2001 IV Mg

Blanchard, Kidney Int, 2001 Témoins Hypercalciurie hypomagnésémie Familiale (PCLN-1 -/- ) Hypercalciurie hypomagnésémie familiale

Syndrome de Gitelman : Hypocalciurie, hypomagnésémie Mutation du cotransporteur NaCl du tube contourné distal sensible aux diurétiques thiazidiques

Cellule Sang Transport de Ca dans le tube contourné distal D’après M Paillard Na + K+K+ K+K+ Lumière Cl - Thiazide ATP Na + Cl - Ca ++ NCX1 ATP NCC Ca ++ TRPV5 Mg TRPV6 Mg ?  TRPV6

25 mg/kg HCTZ ip ECaC ou TRPV5+/+ ECaC ou TRPV5-/- Nijenhuis, JCI 2005 Rôle de TRPV5 dans l’hypocalciurie du syndrome de Gitelman

Microponction in vivo / early proximal tubule 2/ late proximal tubule 3/early distal convoluted tubule 4/late distal convoluted tubule 5/papille Flux de soluté (neq/min) Débit (nl.min -1 ) Flux trans-épithélial (pmol/mm/min)

Nijenhuis, JCI 2005 Rôle du tube proximal dans l’hypocalciurie du syndrome de Gitelman Réabsorption de Ca inversement proportionnelle à la volémie

Principales anomalies génétiques concernant le Ca et le Mg Syndrome de Gitelman Hypokaliémie, hypocalciurie, hypomagnésémie Mutation du cotransporteur sodium-chlore du tube contourné distal Hypomagnésémie par diminution de TRMP6 Hypocalciurie par augmentation de la réabsorption proximale de Ca Hypomagnésémie hypercalciurie familiale Mutation de la paracelline, protéine des jonctions serrées Diminution de la réabsorption paracellulaire de Ca et Mg dans l’anse de Henle

Les Phosphates

23000 mmol 90 % 1 % Répartition des phosphates (PM 90) PO 4 3- HPO 4 2- H 2 PO 4 - PM milieu intra-cellulaire + H + H 3 Ca 3 (PO 4 ) 2.(OH) 2 + H + HPO Ca mmol 9 %

80% Phosphate filtré 20% Phosphate filtré Réabsorption proximale

Excrétion urinaire de Pi (mmol/min) Phosphatémie (mmol/l) TmPi (mmol/min) ,05 0,1 0,15 Excrétion urinaire de phosphate (Tm ou seuil maximal de réabsorption) Inuline Tm/GFR (mmol/l) phosphate Bijvoet, clin chem acta 1969 phosphate réabsorbé phosphate excrété phosphate filtré

Criblage de banque d’ADN But : identifier une molécule dont on suppose la présence dans un tissu sur des arguments fonctionnels Méthode : broyat tissulaire, extraction d’ARNm, transcription inverse en ADNc, découpage, insertion dans des vecteurs Clonage : transfection de bactéries par les vecteurs, sélection des clones transfectés, amplification des clones Expression hétérologue : extraction de l’ADN des clones, ablation du vecteur, transcription en ARNc et injection dans des systèmes cellulaires Etude fonctionnelle (ici, patch-clamp) Application : récepteur sensible au calcium et transporteur NaPi de type 2

Préparation de vésicules de bordure en brosse : cotransport sodium-phosphate D’après Murer, Physiol rev 2000   V ref Vh   V ref Vh 135 mM Na A [Pi] 1 mM [Na] 135 mM

Criblage de banque de cDNA de cortex de rein de lapin Werner, PNAS 1991 Transformation de bactéries Sélection des clones Amplification par repiquage cDNA DNA ligase mRNA Homogénat de cortex Extraction au chloroforme Dissection broyage Reverse transcription Enzyme de restriction Fragments de cDNA vecteur Lysat bactérien plasmides Lyse alcaline cDNA de rein cRNA Enzyme de restriction transcription Clones bactériens Extraction au CsCl

Transport de Pi Transport de SO 4 cRNA correspondant à un pool de clones Werner, PNAS 1991

Séquençage du cDNA du clone sélectionnné Plusieurs séquences correspondant à des gènes Synthèse de sondes spécifiques Northern-blot pour NaPi-2 Magagnin, PNAS 1993

STRUCTURE DU NPT2a ou NaPi-2 (HUMAIN) 640 a.a. 8 domaines transmembranaires Localisation: pôle apical du tube proximal exclusivement