Apport de la PCR digitale Diagnostic Prénatal Non Invasif des Maladies Monogéniques Dr Juliette Nectoux Service de Biologie et Génétique Moléculaires GHU Paris Centre – Site Cochin

D ÉTECTION ET Q UANTIFICATION DES A CIDES N UCLÉIQUES DE F AIBLE A BONDANCE ADN F ŒTAL C IRCULANT PCR DIGITALE Faible quantité absolue Faible quantité relative Sensibilité, spécificité, précision

Mise au point d’un essai Taqman spécifique des chromosomes X et Y D ÉTECTION Q UALITATIVE DE S ÉQUENCES A BSENTES DU G ÉNOME M ATERNEL D ÉTERMINATION N ON I NVASIVE D U S EXE F ŒTAL ZFY (Fam) ZFX (Hex) ZFY (Fam) ZFX (Hex) % théorique allèle Y 50%25%12%6%3%1.5%0.8%0% NTC 1D FLUORESCENCE 2D FLUORESCENCE

Mise au point d’un essai Taqman spécifique des chromosomes X et Y D ÉTECTION Q UALITATIVE DE S ÉQUENCES A BSENTES DU G ÉNOME M ATERNEL D ÉTERMINATION N ON I NVASIVE D U S EXE F ŒTAL ZFY (Fam) ZFX (Hex) 50%25%12%6%3%1.5%0.8%0% NTC Fœtus de sexe féminin Fœtus de sexe masculin NTC % théorique allèle Y

Mise au point d’un essai Taqman spécifique des chromosomes X et Y D ÉTECTION Q UALITATIVE DE S ÉQUENCES A BSENTES DU G ÉNOME M ATERNEL D ÉTERMINATION N ON I NVASIVE D U S EXE F ŒTAL ZFY (Fam) ZFX (Hex) 50%25%12%6%3%1.5%0.8%0% NTC Fœtus de sexe féminin Fœtus de sexe masculin NTC % théorique allèle Y

Mise au point d’un essai Taqman spécifique des chromosomes X et Y D ÉTECTION Q UALITATIVE DE S ÉQUENCES A BSENTES DU G ÉNOME M ATERNEL D ÉTERMINATION N ON I NVASIVE D U S EXE F ŒTAL ZFY (Fam) ZFX (Hex) 50%25%12%6%3%1.5%0.8%0% NTC Fœtus de sexe féminin Fœtus de sexe masculin NTC % théorique allèle Y

D ÉTECTION Q UALITATIVE DE L ’ADN F ŒTAL P LASMATIQUE M ISE AU POINT D ’ UN E SSAI RASSF1A MÉTHYLATION DÉPENDANT * Pré-digestion Post digestion BstUI RASSF1A (Fam) ACTINE B (Hex) ADN maternel + fœtal ADN fœtal RASSF1A (Fam) ACTINE B (Hex) Contrôle de digestion Digestion BstUI * Adapté de Chan et al, 2006Orhant et al, Ann Biol Clin, 2016

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS D E N OVO A CHONDROPLASIE D ÉTECTION Q UALITATIVE D E LA M UTATION FGFR3 C.1138G>A DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE Event number Pre-digestedPost-digested BstUI FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN Orhant et al, Prenat Diag, 2016 Famille ACHO134 c.1138G>A, p.Gly380Arg

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS D E N OVO A CHONDROPLASIE D ÉTECTION Q UALITATIVE D E LA M UTATION FGFR3 C.1138G>A DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE Event number Pre-digestedPost-digested BstUI FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN Orhant et al, Prenat Diag, 2016 Famille ACHO134 c.1138G>A, p.Gly380Arg

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS D E N OVO A CHONDROPLASIE D ÉTECTION Q UALITATIVE D E LA M UTATION FGFR3 C.1138G>A DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE Event number Pre-digestedPost-digested BstUI FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN FGFR3 c.1138A FGFR3 c.1138G RASSF1A B ACTIN Orhant et al, Prenat Diag, 2016 Famille ACHO134 c.1138G>A, p.Gly380Arg

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS P ATERNELLES N EUROFIBROMATOSE DE T YPE I PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.1381T NF1 c.1381C Famille F c.1381C>T NF1 c.1381T NF1 c.1381C Event number NF1 c.499_502del NF1 WT Famille F c.499_502delTGTT PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.499_502del D ÉTECTION Q UALITATIVE D E M UTATIONS NF1 DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS P ATERNELLES N EUROFIBROMATOSE DE T YPE I PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.1381T NF1 c.1381C Famille F c.1381C>T NF1 c.1381T NF1 c.1381C Event number NF1 c.499_502del NF1 WT Famille F c.499_502delTGTT PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.499_502del D ÉTECTION Q UALITATIVE D E M UTATIONS NF1 DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS P ATERNELLES N EUROFIBROMATOSE DE T YPE I PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.1381T NF1 c.1381C Famille F c.1381C>T NF1 c.1381T NF1 c.1381C Event number NF1 c.499_502del NF1 WT Famille F c.499_502delTGTT PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.499_502del D ÉTECTION Q UALITATIVE D E M UTATIONS NF1 DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE

D ÉTECTION Q UALITATIVE DES M UTATIONS P ATERNELLES N EUROFIBROMATOSE DE T YPE I PèreMèreFœtusPlasmaBlanc NF1 c.1381T NF1 c.1381C Famille F c.1381C>T Père 765 WT 750 mut Mère 801 WT 0 mut Fœtus 1837 WT 0 mut Plasma 2984 WT 2 mut Event number NF1 c.499_502del NF1 WT Famille F c.499_502delTGTT PèreMèreFœtusPlasmaBlanc Père 515WT 501del Mère 910WT 0del Fœtus 434WT 396del Plasma 1867 WT 11del D ÉTECTION Q UALITATIVE D E M UTATIONS NF1 DANS LE PLASMA DE P ATIENTE E NCEINTE 3,3 % 0,6% 0,06% 0 %

D OSAGE R ELATIF DE M UTATION Détermination du Ratio Allélique D ÉTECTION Q UANTITATIVE DES M UTATIONS TRANSMISES PAR LA M ÈRE Détermination du % ADNf

D ÉTECTION Q UANTITATIVE DES M UTATIONS TRANSMISES PAR LA M ÈRE Nectoux & Rozenholc, soumis

Evaluation de la fraction fœtale Evaluation du ratio allélique Sequential Probability Ratio Test * ZFY ZFX CFTR p.Phe508del CFTR WT D ÉTECTION Q UANTITATIVE DES M UTATIONS M ATERNELLES M UCOVISCIDOSE D ÉTECTION Q UANTITATIVE D E LA M UTATION CFTR p.Phe508del DANS LE PLASMA DE P ATIENTE HTZ E NCEINTE N / m m / mm / m * Adapté de Lo et al, 2006 Ratio allélique théorique Nb de gouttelettes analysées

R EMERCIEMENTS Lucie Orhant Caroline Beugnet Nathalie Deburgrave Gilles Tafuri Aurélie Vasson Isabelle Atlan Thierry Bienvenu Emmanuelle Girodon Dominique Vidaud Catherine Costa France Leturcq Michel Vidaud Marc Delpech …Et tous les collègues avec qui nous collaborons! Vassilis Tsatsaris François Goffinet Olivia Anselem Camille Rampon Françoise Lerhun Géraldine Viot Laila El Khattabi Jean Michel Dupont Franck Letourneur Juliana Pipoli Martial Saumier Yves Rozenholc Dorota Desaulle