Structure cristallographique d’une jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaison Jérémie Pitona, Odile Lecompteb, Olivier Mauffretc, Olivier Pochb, Claudine Mayera aCRC Pôle 4 Equipe 12 - Site Pitié-Salpêtrière, UMRS 872 INSERM, 91 bd de l'Hôpital, 75013 Paris. bIGBMC, Département de Biologie et Génomique Structurales, IGBMC, 1 rue Laurent Fries, 67404 Illkirch. cLBPA, UMR 8113 CNRS, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex. E-mail: piton@chups.jussieu.fr Résumé Études structurales d’une jonction de Holliday La recombinaison homologue est impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Décrite à l’origine comme responsable de la diversité génétique en créant de nouvelles combinaisons de gènes, la recombinaison possède des rôles très importants dans la ségrégation des chromosomes, l’intégration virale, la stabilité et le maintien du génome… L’étape principale de la recombinaison homologue est la formation d’un complexe formé de quatre brins d’ADN appelé jonction de Holliday qui conduit à deux doubles hélices d’ADN recombinées. Il est donc nécessaire de caractériser cette structure quaternaire d’ADN pour comprendre les causes de leurs formations ainsi que le mode de reconnaissance avec les protéines impliquées dans la recombinaison, telles que les recombinases ou les résolvases. Dans le cadre d’études de relations structure-fonction d'une famille d'ATPases atypiques d'archaea [1] (dénommées A5+) possédant un domaine résolvase et jouant ainsi un rôle potentiel dans la recombinaison, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide amphimorphique, c'est-à-dire qui cristallise sous plusieurs formes (forme A, forme B ou jonction de Holliday). Des travaux antérieurs montrent que le passage d’une forme à une autre est dépendant de la séquence et de la concentration en ions. L’oligonucléotide CCGATATCGG cristallise en forme B dans le groupe d’espace P212121 en présence de 5 mM CaCl2, et en forme jonction de Holliday dans le groupe d’espace C2 avec 100 mM CaCl2 [2]. Des cristaux de cet oligonucléotide ont ici été obtenus en présence de 30 mM MgCl2, conditions jamais décrites dans la littérature. L’oligonucléotide cristallise dans le groupe d’espace C2 avec les paramètres de maille a = 64,26 Å, b  = 24,37 Å, c = 37,97 Å, β = 111,39°. Nous présentons ici la structure résolue à 2.3 Å en forme jonction de Holliday ainsi qu'un modèle d'interaction avec les protéines A5+. Dans le cadre d’études des relations structure – fonction des protéines de la famille A5+, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide en forme Jonction de Holliday. Forme Open X ou Stacked X ? Seule forme cristallisable sans protéine Problématique Oligonucléotide amphimorphique : cristallise sous plusieurs formes forme A, forme B, jonction de Holiday  Influence de la séquence... … et de la nature des ions 23 structures de type jonction de Holliday dans la NDB 8 séquences non redondantes CCGATATCGG CCGATATCGG CCGCTAGCGG CCGGTACCGG TCGGTACCGA CCGGCGCCGG CCAGTACUGG CCGGGCCCGG CCGGGACCGG + Mg2+ + Ca2+ (100mM) + Ca2+ (5mM) + Na+ ? La recombinaison homologue Forme HJ 1ZF3 Forme B 1ZFC Forme HJ 1ZF4 Intermédiaire de la recombinaison : Jonction de Holliday, structure quaternaire d’ADN Pu : Base purine Py : base pyrimidine Conditions de cristallisation 50 mM cacodylate de sodium, 1 mM spermine, 30 mM MgCl2 et 30 % MPD Statistiques de la collecte Protéines moteurs : permet à la jonction de glisser Protéines résolvases : hydrolyse la jonction de Holliday libérant les 2 hélices recombinées Intermédiaire de la recombinaison, jonction de Holliday 2 Formes en solution Source des rayons X BM30A (ESRF) 11723 (1760) Groupe d’espace C2 No. d’observations a = 64.36, b =24.37, c = 37.97  = 111.39 No. reflexions unique 2845 (428) Paramètres de maille (Å,°) Complétude (%) 96,9 (93,4) Longueur d’onde (Å) 0.974 Redondance 4.1 (4.1) Résolution (Å) 50-2.2 (2.3-2.2) I/(I) 11,91 (7,4) Rsym† (%) 7,4 (29,8) Jonction de Holliday Forme « open X » Forme « stacked X » No. Mol. dans U.A. 2 Interactions protéines - ADN : - Protéines tetramériques reconnaissent la forme « open X » Ex : RuvAB, intégrase, etc… - Protéines dimériques reconnaissent la forme « stacked X » Ex : Résolvase, endonucléase, etc… Remplacement Moléculaire  Forme B, Forme HJ ? Forme Modèle B 1ZFC Organisation en domaines des protéines de la famille A5+ OK Forme Jonction de Holliday HJ 1ZF3 Domaine de liaison à l’ADN Winged Helix (100 aa) Affinement et structure de HJ_Mg Affinement : CNS Influence des conditions de cristallisation N Domaine AAA+ Domaine WH Domaine Résolvase C En cours d’affinement… R = 0,22 Rfree = 0,32 Domaine d’hydrolyse de l’ATP (280 aa) Domaine Résolvase de jonction de Holliday (120 aa) Unité biologique AXE 2 Interaction avec jonction de Holliday en forme « stacked X », rôle dans la recombinaison Proposition d’un modèle d’interaction Jonction de Holliday Domaine de liaison à l’ADN HJ_Mg 1ZF3 ADN forme B  Modifications structurales par rapport à 1ZF3 Unité asymétrique Symétrique généré par l’axe 2 cristallographique = Unité biologique Effets des ions Mg2+ ? Domaine d’hydrolyse de l’ATP Domaine résolvase de jonction de Holliday Références bibliographiques : [1] Lecompte O., Ripp R., Puzos-Barbe V., Duprat S., Heilig R., Dietrich J., Thierry J.-C., Poch O., Genome Res., 2001, 11, 981-993. [2] Hays F.A., Vargason J.M., Ho, P.S. Biochemistry, 2003, 42, 9546-9597. 1 monomère Remerciements : Nous remercions l’équipe de cristallographie du laboratoire UMRS 872 INSERM et en particulier Vanessa Delfosse et Stephanie Petrella, ainsi que Michel Pirrochi de la ligne FIP-BM30A pour son aide lors des collectes de données.