Production de l’hormone de croissance par transgénèse Lou FREUDIGER Jean ESNAULT

L’hormone de croissance Aussi appelée somatropine Hormone protéique de 191 acides aminés secrétée par les cellules somatotropes de la partie antérieure de l’hypophyse, qui stimule la croissance et la reproduction cellulaire chez les humains et les autres vertébrés. Son insuffisance empêche les enfants d’atteindre une taille normale.

Structure de la GH forme globuleuse structure relativement simple : elle comprend des hélices et des coudes. La structure est maintenue par des liaisons hydrogènes et 2 ponts disulfures

La transgénèse Définition: Technique servant à introduire un gène étranger dans le génome d'un organisme, en vue d'obtenir un organisme génétiquement modifié. Pour être réussie la transgénèse nécessite: - la pénétration du gène d’intérêt dans la cellule-cible - son intégration dans le génome - son aptitude à s'exprimer dans la cellule (production d'une protéine)

La transgénèse Mécanisme: Le gène cible, gène permettant la production d’hormone de croissance, ayant été identifié et isolé, est inséré dans un plasmide qui est introduit dans la bactérie Escherichia coli. Les bactéries transgéniques ainsi obtenues après multiplication, sont placées en culture sur un milieu approprié, dans un fermenteur. Puis les bactéries transgéniques expriment ce gène et synthétisent de l'hormone de croissance identique à l'hormone de croissance humaine, que l'on récupère sans risque en vue des injections.

Première tentative Construction d’un gène hybride permettant à la bactérie de produire une version presque normale de l’hGH mature. Synthèse ADN codant les aa 1 à 24. Ajout d’un triplet ATG en amont du premier codon. ADN codant les acides aminés 25 à 191 a été obtenu à partir d'ARNm de cellules hypophysaires humaines. Clonage de ces 2 fragments en aval du promoteur lac dans un plasmide. Introduction de ce plasmide recombinant dans E. coli où il produisait l'hormone de croissance humaine à l'intérieur des cellules. Inconvénients: cette hGH commençait par une méthionine qui n'était pas séparée du restant du polypeptide par les enzymes de E. coli. De plus, comme la protéine était synthétisée à l'intérieur des cellules, il fallait de nombreuses étapes pour séparer l'hGH des milliers de protéines bactériennes intracellulaires.

Seconde tentative Modification de la protéine de manière à ce qu'elle soit sécrétée. Ligation de la séquence codante de la protéine hGH à la séquence signal d'une protéine bactérienne sécrétée. L’hGH produite par les bactéries était sécrétée dans l'espace périplasmique avec élimination concomitante du signal peptidique par une protéase bactérienne. Libération de la protéine par choc hypotonique. L'hGH produite de cette manière ne contient pas de méthionine initiatrice puisqu'une protéase périplasmique a coupé la séquence signal.

La transgénèse- Bilan L'ARNm codant l’hGH est isolé de l’organisme donneur. L'ARNm permet la synthèse de l'ADNc (complémentaire) qui sera utilisé pour le clonage. En effet, l'ADN génomique eucaryote n'est pas utilisable dans un système bactérien car les bactéries ne possèdent pas la machinerie d'épissage des ARNm eucaryotes. L’ADNc amplifié par PCR est inséré dans un vecteur : plasmide bactérien. Coupure par des enzymes de restriction et ligation de l'ADNc dans le plasmide à l'aide d'une ligase. Introduction du plasmide recombinant dans une bactérie par transformation. Les bactéries se multiplient et sont mises en culture. Obtention d’hGH .

L’organisme donneur Le fragment d’ADN de départ est un fragment d'ADN humain contenant le gène de l'hormone de croissance. L’organisme donneur est donc une cellule hypophysaire humaine. Le gène impliqué dans la biosynthèse de hGH est situé sur le bras long du chromosome 17

L’OGM - Présentation L’organisme génétiquement modifié, dans le but de produire de l’hormone de croissance en grande quantité, est la bactérie Escherichia coli, de la famille des Enterobacteriaceae. Les bactéries se prêtent particulièrement aux expériences de transgénèse car il est techniquement facile de leur faire intégrer des plasmides, petites molécules d’ADN circulaire que de nombreuses bactéries contiennent naturellement. 

L’OGM- Intérêts de son utilisation Comme on peut cultiver des cellules bactériennes en masse à faible coût, les bactéries incorporant des gènes recombinants peuvent synthétiser de grandes quantités des protéines codées par ces gènes. Cette méthode de fabrication de l’hormone de croissance est beaucoup plus productive et plus sûre que l’ancienne. En effet, l’HG était extraite d’hypophyses de cadavres. 1.500 hypophyses étaient nécessaires à la fabrication d’un lot d’hormone. Et des cas de contamination par le prion responsable de la maladie de Creutzfeld-Jacob ont été recensés.

Avantages par rapport à la GH extractive: Facilité d’obtention Diminution du coût (même si il reste important) Diminution de l’immunogénicité Absence de risque infectieux

Opinion publique Cet OGM a bien meilleure réputation que certains de ses confrères. En effet, ayant un impact favorable sur la santé, cet OGM ne fait pas l’objet de critiques particulières. L’augmentation de la production de l’hormone de croissance a engendré un usage abusif de cette hormone à des fins de dopages, afin d’augmenter le volume musculaire.

Opinion du CHMP Le comité des médicaments à usage humain (CHMP) a finalisé en mai 2011, la première étape de réévaluation du risque des spécialités contenant de l’hormone de croissance recombinante. Le CHMP a confirmé que la balance bénéfice-risque de ces médicaments restait positive dans les indications et les doses approuvées dans les autorisations de mise sur le marché. L’Afssaps recommande aux prescripteurs de respecter strictement les indications et de ne pas dépasser la dose maximale recommandée pour chaque indication.

Conclusion L’utilisation d’hGH synthétique a été généralisée en France à partir de 1988, après que la méthode d’extraction de l’hormone sur des hypophyses de cadavres ce soit avérée dangereuse. Actuellement, les industries biotechnologiques produisent l’hormone de croissance par génie génétique. C’est la bactérie Escherichia coli qui est capable de produire cette hormone. Une seule cuve contenant 500 litres produit la même quantité d’hormone de croissance que 35 000 hypophyses humaines. L’utilisation d’un OGM est donc plus sûre et diminue le coût ainsi que le temps de fabrication de l’hGH.

Bibliographie/Webographie Biologie, Raven, De boeck.1279 pages Microbiologie, De Boeck, 1088 pages http://www.futura- sciences.com/fr/doc/t/medecine1/d/hormone-de- croissance_1042/c3/221/p4/ http://ansm.sante.fr/S-informer/Informations-de-securite- Lettres-aux-professionnels-de-sante/Hormone-de-Croissance- recombinante-somatropine-recombinante-actualisation-des- donnees-sur-le-rapport-benefice-risque-Lettre-aux- professionnels-de-sante/%28language%29/fre-FR http://www.repere-medical.com/article-112.html