J’ai fait séquencer mes petits ARN. Et Maintenant ? Introduction à l’analyse des données de séquençage à haut débit en génomique fonctionnelle. 28 mars 2012, 15:30 – 17:00 J’ai fait séquencer mes petits ARN. Et Maintenant ? Christophe.antoniewski@upmc.fr http://drosophile.org

Les trois principales classes de petits ARNs chez la drosophile met Hen1 Produits des snoRNA, tRNA, rRNA. 2S Droso (30nt) +

small RNA deep sequencing (Biases) 20-30nt RNA gel purification Library “Bar coding”

Que Puis-je Faire avec mes séquences de petits ARN ? Annotation Visualisation Découverte de loci Quantification d’expression Analyse structurale des précurseurs, signatures, … Mise en évidence de « visiteurs » (virus, …) … Informatique  Bioinformatique

Matériel Un fichier de séquence au format fastq Un ordinateur avec ~ 8 Mo RAM Un « Operating System Unix compliant » Un maniement confortable de cet OS Quelques logiciels génériques très utiles Un « vrai » éditeur de texte (TextWrangler, etc..) R, Gnuplot … Une bonne connaissance du web Le maniement niveau Débutant++ d’un langage de programmation Perl Python

Que contient le gros fichier fastq que j’ai téléchargé (et décompressé) ? * Limite max pour ouvrir un gros fichier texte (~1.2 Go) Terminal Unix. Naviguer dans le dossier qui contient le fichier Taper la commande more <nom_du_fichier> lbcd-05:GKG13demo deepseq$ more GKG-13.fastq @HWIEAS210R_0028:2:1:3019:1114#AGAAGA/1 TNGGAACTTCATACCGTGCTCTCTGTAGGCACCATCAA +HWIEAS210R_0028:2:1:3019:1114#AGAAGA/1 bBb`bfffffhhhhhhhhhhhhhhhhhhhfhhhhhhgh @HWIEAS210R_0028:2:1:3925:1114#AGAAGA/1 TNCTTGGACTACATATGGTTGAGGGTTGTACTGTAGGC +HWIEAS210R_0028:2:1:3925:1114#AGAAGA/1 ]B]VWaaaaaagggfggggggcggggegdgfgeggbab @HWIEAS210R_0028:2:1:6220:1114#AGAAGA/1 +HWIEAS210R_0028:2:1:6220:1114#AGAAGA/1 aB^^afffffhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhchhhh @HWIEAS210R_0028:2:1:6252:1115#AGAAGA/1 +HWIEAS210R_0028:2:1:6252:1115#AGAAGA/1 aBa^\ddeeehhhhhhhhhhhhhhhhghhhhhhhefff @HWIEAS210R_0028:2:1:6534:1114#AGAAGA/1 TNAATGCACTATCTGGTACGACTGTAGGCACCATCAAT +HWIEAS210R_0028:2:1:6534:1114#AGAAGA/1 aB\^^eeeeegcggfffffffcfffgcgcfffffR^^] @HWIEAS210R_0028:2:1:8869:1114#AGAAGA/1 GNGGACTGAAGTGGAGCTGTAGGCACCATCAATAGATC +HWIEAS210R_0028:2:1:8869:1114#AGAAGA/1 aBaaaeeeeehhhhhhhhhhhhfgfhhgfhhhhgga^^ … … …

Combien de séquences dans mon fichier ? Terminal Unix. Naviguer dans le dossier qui contient le fichier Taper la commande wc - l <nom_du_fichier> lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq 25703828 GKG-13.fastq >>> 25 703 828 / 4 6 425 957 séquences

Mes séquences contiennent-elles le bon adaptateur ? Séquence de mon adaptateur: CTGTAGGCACCATCAAT Taper la commande cat <nom_du_fichier> | grep CTGTAGG | wc -l lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq | grep CTGTAGG | wc -l 6355061 6 355 061 sur 6 425 957 séquences Pas mal A contrario lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq | grep ATCTCGT| wc -l 308

Quelle est la qualité de mes séquences ? http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

Comment retirer l’adaptateur ? http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html Séquence de mon adaptateur: CTGTAGGCACCATCAAT deepseq$ fastq_to_fasta -r –n -i GKG-13.fastq -o GKG-13.fasta deepseq$ more GKG-13.fasta >1 AATGGCACTGGAAGAATTCACCTGTAGGCACCATCAAT >2 TCTCGGTAGAACCTCCACTGTAGGCACCATCAATAGAT >3 TTTGTGACCGACACTAACGGGTACTGTAGGCACCATCA >4 TGGAATGTAAAGAAGTATGGAGCTGTAGGCACCATCAA >5 GTCAGCAACTTGATTCCAGCAATCTGTAGGCACCATCA >6 AATGGCACTGGAAGAATTCACGGGCTGTAGGCACCATC >7 TGGAAGACTAGTGATTTTGTTCTGTAGGCACCATCAAT >8 TGAACACAGCTGGTGGTATCCCTGTAGGCACCATCAAT deepseq$ fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 18 -i GKG-13.fasta -o GKG-13_clipped.fasta >18 AATGGCACTGGAAGAATTCAC >20 TTTGTGACCGACACTAACGGGTA >21 TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG >22 GTCAGCAACTTGATTCCAGCAAT >23 AATGGCACTGGAAGAATTCACGGG >24 TGGAAGACTAGTGATTTTGTT >25 TGAACACAGCTGGTGGTATCC >26 TAAGTACTAGTGCCGCAGGA >27 TGAACACAGCTGGTGGTATC >28 TAGGAACTTCATACCGTGCTCT deepseq$ more GKG-13_clipped.fasta deepseq$ fastq_to_fasta -r -n -i GKG-13.fastq | fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 18 -o GKG-13_clip-pipe.fasta

J’utilise fastx_clipper et fastQC pour visualiser la distribution de taille de mes séquences deepseq$ fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 0 -i GKG-13.fastq -o GKG-13_clipped.fastq deepseq$ more GKG-13_clipped.fastq @HWIEAS210R_0028:2:1:1313:1120#AGAAGA/1 AATGGCACTGGAAGAATTCAC +HWIEAS210R_0028:2:1:1313:1120#AGAAGA/1 fe\gggd\fgeeeggdaggag @HWIEAS210R_0028:2:1:1387:1119#AGAAGA/1 TCTCGGTAGAACCTCCA +HWIEAS210R_0028:2:1:1387:1119#AGAAGA/1 gggggeggfffgggfff @HWIEAS210R_0028:2:1:1849:1120#AGAAGA/1 TTTGTGACCGACACTAACGGGTA +HWIEAS210R_0028:2:1:1849:1120#AGAAGA/1 hhhhhhhhhfhgfhhhhgehhha

Je télécharge Bowtie, je l’installe, et je lis le manuel http://bowtie-bio.sourceforge.net/ Bowtie aligne des reads sur un génome de référence préalablement préparé Je télécharge Bowtie, je l’installe, et je lis le manuel Je télécharge mon génome au format FASTA Je prépare mon « index » Bowtie deepseq$ bowtie-build fasta_libraries/dmel-all-chromosome-r5.37.fasta dmel-r5.37 ~5 min deepseq$ ls –laht -rw-r--r-- 1 deepseq staff 49M Mar 24 17:24 dmel-r5.37.rev.1.ebwt -rw-r--r-- 1 deepseq staff 19M Mar 24 17:24 dmel-r5.37.rev.2.ebwt -rw-r--r-- 1 deepseq staff 49M Mar 24 17:20 dmel-r5.37.1.ebwt -rw-r--r-- 1 deepseq staff 19M Mar 24 17:20 dmel-r5.37.2.ebwt -rw-r--r-- 1 deepseq staff 331K Mar 24 17:16 dmel-r5.37.3.ebwt -rw-r--r-- 1 deepseq staff 39M Mar 24 17:16 dmel-r5.37.4.ebwt

J’aligne mes reads avec bowtie deepseq$ bowtie ~/bin/bowtie/indexes/5.43_Dmel/5.43_Dmel -f GKG-13_clip-pipe.fasta -v 1 -k 1 -p 12 --al droso_matched_GKG-13.fa --un unmatched_GKG13.fa > GKG13_bowtie_output.tabulated ~/bin/bowtie/indexes/5.43_Dmel/5.43_Dmel -f GKG-13_clip-pipe.fasta -v 1 -k 1 -p 12 --al droso_matched_GKG-13.fa --un unmatched_GKG13.fa > GKG13_bowtie_output.tabulated # reads processed: 5997502 # reads with at least one reported alignment: 5045151 (84.12%) # reads that failed to align: 952351 (15.88%) Reported 5045151 alignments to 1 output stream(s)

… et je récupère Un fichier d’alignement deepseq$ ls -laht -rw-r--r-- 1 deepseq staff 351M Mar 24 17:46 GKG13_bowtie_output.tabulated -rw-r--r-- 1 deepseq staff 156M Mar 24 17:46 droso_matched_GKG-13.fa -rw-r--r-- 1 deepseq staff 28M Mar 24 17:46 unmatched_GKG13.fa Un fichier d’alignement deepseq$ more GKG13_bowtie_output.tabulated 21 + 2L 20487495 TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG 30 - 3L 15836559 GTGAATTCTCCCAGTGCCAAG 25 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATCC 23 - 2L 11953462 CCCGTGAATTCTTCCAGTGCCATT 27 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATC 26 - 3R 9289997 TCCTGCGGCACTAGTACTTA 18 - 2L 11953465 GTGAATTCTTCCAGTGCCATT 22 - 3R 8377246 ATTGCTGGAATCAAGTTGCTGAC 20 + 3L 11650036 TTTGTGACCGACACTAACGGGTA 24 + 2R 16493585 TGGAAGACTAGTGATTTTGTT 28 + 3L 10358380 TAGGAACTTCATACCGTGCTCT 35 + X 18022302 CTTGTGCGTGTGACAGCGGCT 41 - 3RHet 138608 TGGCGACCGTGACAGGACCCG 42 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATCC Un fichier des séquences alignées Un fichier des séquences non alignées deepseq$ more droso_matched_GKG-13.fa >21 TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG >26 TAAGTACTAGTGCCGCAGGA >24 TGGAAGACTAGTGATTTTGTT >23 AATGGCACTGGAAGAATTCACGGG >27 TGAACACAGCTGGTGGTATC deepseq$ more unmatched_GKG13.fa >29 AGGGGGCTATTTCACTACTGGA >33 CGATGATGACGGTACCCGTAGA >37 GCTAGTCGGTACTTGAAAC >59 TGGTTGCAATAGCTTCTGGCGGA >61 GATGAGTGCTAGATGTAGGGA

Un pipeline d’annotations « génomiques » Sequence reads (fasta format) Bowtie Pre-miRNAs (miRBase) Matched reads (fasta) Read Count Unmatched reads Bowtie Non coding RNAs Matched reads (fasta) Read Count Unmatched reads hierarchical annotation of sequence datasets Bowtie Transposons Matched reads (fasta) Read Count Unmatched reads Bowtie Genes Matched reads (fasta) Read Count Unmatched reads Bowtie Intergenic regions Matched reads (fasta) Read Count Unmatched reads Bowtie Viruses, transgenes, etc… Matched reads (fasta) Read Count Remaining unmatched sequences

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser » http://samtools.sourceforge.net/ Un pipeline sommaire pour préparer un fichier de visualisation deepseq$ bowtie -v 1 -M 1 --best /Users/deepseq/bin/bowtie/indexes/5.37_Dmel -p 12 -f GKG-13_clip-pipe.fasta -S | samtools view -bS -o GKG-13_clip-pipe.fasta.bam - ; samtools sort GKG-13_clip-pipe.fasta.bam GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted ; samtools index GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted.bam 306K GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted.bam.bai 42M GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted.bam 80M GKG-13_clip-pipe.fasta.bam 

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser » (2) J’upload mes fichiers bam et bai sur un serveur accessible J’indique l’URL du fichier bam à Ensembl (Gbrowse, Modencode, etc..)

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser » (3) Je navigue dans les régions d’intérêt, après avoir indiqué au Browser d’inclure mon « track »

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser » (4) Encore un…

Un “profiler” maison pour les micros ARNs deepseq$ miRNA_bowtie_profiler.py GKG-13_clip-pipe.fasta ~/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17.1.ebwt Sequence reads (fasta format) Bowtie Pre-miRNAs (miRBase) Indéxé pour Bowtie Bowtie Output Analyse “textuelle” Cartes des reads par miRNA Liste de comptage par miR_5p et miR_3p # bowtie -v 1 -M 1 --best --strata -p 12 --norc --suppress 2,6,7,8 /Users/deepseq/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17 -f GKG-13_clip-pipe.fasta # reads processed: 5997502 # reads with at least one reported alignment: 3886779 (64.81%) # reads that failed to align: 2060565 (34.36%) # reads with alignments sampled due to -M: 50158 (0.84%) Reported 3886779 alignments to 1 output stream(s) # Parsing completed in 1 minutes and 36.7 seconds

miRNA_bowtie_profiler.py : Cartes des reads, par miR offsets counts sizes

miRNA_bowtie_profiler.py : Attribution des reads “5p” et “3p” miRs « 5p » miRs « 3p » + 987 reads 16003 reads = 16990, ~ 17009 reads *

miRNA_bowtie_profiler.py : Liste de comptage des miRs

Analyse d’expression différentielle deepseq$ miRNA_bowtie_profiler.py GKG-13_clip-pipe.fasta ~/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17.1.ebwt Sequence reads (fasta format) Pre-miRNAs (miRBase) Indéxé pour Bowtie Bowtie Bowtie Output Analyse “textuelle” Cartes des reads par miRNA Liste de comptage par miR_5p et miR_3p http://www.r-project.org/ DESeq Heatplus edgeR (Bioconductor)

Profiling des miRNAs durant la métamorphose de la drosophile days L3 PF PF+12h Ecdysone titer Read count table

Clustering of miRNA read counts after normalization days L3 PF PF+12h Clustering of miRNA read counts after normalization Ecdysone titer DESeq Heatplus

Analyse d’expression différentielle PF PF+12h Larva « Differential calling » avec le jeu complet de données Metamorphosis Up-regulated 27 Down_regulated « Differential calling » sans replicats Metamorphosis Up-regulated Down_regulated Message: Le Deep Seq n’échappe pas au tests statistiques Les réplicats sont nécessaires pour estimer le bruit biologique

Naive and primed murine pluripotent stem cells have distinct miRNA signatures ESC1 ESC2 EpiSC2 EpiSC1 EpiSC3 miR-290-295 miR-302/367 miR17-92 M. Cohen-Tannoudji (Institut Pasteur) Jouneau (INRA Jouy en Josas) E. Heard (Institut Curie) C. Antoniewski (Institut Pasteur) 28/40

Normalized miR read count profiles 29/40

A lattice of miR read profiles for rapid, visual annotation 30/40

31/40

“Stereo” lattice reveals changes in miR biogenesis between ES and EpiSCs % length ESC EpiSC 32/40

Small RNA signatures AUGCUUUCAUGGCAUCCUUAC UUUACGAAAGUACCGUAGGAA -100 +100 ||||||||||||||||||||| 123456789.........19...

Signature piRNA P-element Cartographie des ARN de 24-26nt d’ovaires de drosophile UUGCUUUCAUGGCAUCCUUACCGAUC AGCUUCUUUACGAAACGAAAGUACCG -100 ||||||||||||||||||||| +100 12345678910.............

Signature piRNA P-element Cartographie des ARN de 24-26nt d’ovaires de drosophile UUGCUUUCAUGGCAUCCUUACCGAUC AGCUUCUUUACGAAACGAAAGUACCG -100 ||||||||||||||||||||| +100 12345678910.............