Cours Spectrométrie de Masse L’ionisation par électropray : l’ESI Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique Dir : Alain Van Dorsselaer UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg Tel: 03 68 85 26 79 sarah.cianferani@unistra.fr Cours ESBS Oct 2010

Les Sources d’Ionisation les plus utilisées Ionisation à Impact électronique (IE) Ionisation Chimique (IC) Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides (LSIMS ou FAB) Petites molécules volatiles et thermostables DURES molécules < 6000 Da ASSEZ DOUCES Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI) Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI) Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique DOUCES

L’ionisation par électropray : l’ESI Deux méthodes d’ionisation des biomolécules particulièrement efficaces et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment améliorées : le MALDI et l’ESI (ElectroSpray Ionisation). L’ESI a les caractéristiques suivantes : - nécessite une introduction de l’échantillon en solution - génère des ions multichargés (analyse de protéines) - fonctionne à pression atmosphérique - souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe d’ions.

La source ES : historique jusqu’en 1987 : limite de poids moléculaire des composés analysables par MS : 35000 Da dans les cas les plus favorables depuis 1988-89 : apparition de la technique d’ionisation par électronébulisation (electrospray) et possibilité d’analyser des composés de plusieurs centaines a plusieurs millions de Da) 2002 :John. B. FENN : Prix Nobel pour le développement de la technique d’ionisation pour l’analyse des biomolécules (1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B. Anal. Chem. 57, 675-679 (1985) 2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, 1702-1708, (1989)

Principe de l’ionisation Electrospray (ES) L’ionisation ES repose sur l’introduction d’une solution aqueuse du composé à analyser par un capillaire métallique très fin porté à un haut potentiel Cette tension crée des charges dans la solution A la sortie du capillaire, on a un « nébulisat » (spray) de gouttelettes (1 m) favorisé par une assistance pneumatique L’ionisation par électrospray: ESI - génère des ions multichargés - souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe d’ions.

Structure d’une source d’ionisation Electrospray (ES) Une source d’ionisation par ES est composée : - d’un capillaire dans lequel est injecté l’échantillon à analyser en solution - d’un ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la zone à pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé L’ionisation ES est un processus qui a lieu : - à température ambiante - à pression atmosphérique (ambiante) - sous l’action d’un champ électrique L’ionisation ES génère des ions multichargés V = 3000V 3 à 5 l/min cap. métal (75 m) + + + TOF D Electrospray: Formation de gouttelettes chargées contenant la protéine Zone de désolvatation focalisation des ions Analyse des produits en fonction de leur rapport m/z

L’ionisation par électronébulisation (electrospray): ES+ Elle est basée sur un processus électrolytique de : H2O H+ + OH- Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante Certains OH - sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH - OH. Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à cause d’un excès de protons qui se fixent les sites protonables.

L’ionisation électrospray : principe de la production du spray Débit imposé par une pompe Tube capillaire 0 volt Champ électrique qui agit sur le liquide chargé + 2000 volts ………… Effet de pointe qui entraîne la déformation du liquide en gouttelettes chargées + 3000 volts Emission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés. Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe.

Electrospray: Formation de gouttelettes chargées sous l’effet d’un champ électrique

L’ionisation électrospray : mécanisme de formation des ions ………… Émission d’un spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés L’ionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes: 1- production de gouttelettes chargées à partir de l’électrolyte en solution 2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites 3- « transfert » des ions en phase gazeuse  + + ++ Evaporation du solvant + Réduction de taille, mais nombre de charges électriques constant (explosions coulombiennes)

L’ionisation électrospray : mécanisme Au cours du trajet des ions dans le spectromètre de masse, il y a évaporation du solvant des gouttelettes. - diminution de la taille de la gouttelette - et augmentation parallèle de la densité de charges au sein de la gouttelette Il y a un équilibre entre tension de surface de la gouttelette et forces de répulsions coulombiennes. Plus le solvant s’évapore, plus les forces de répulsion coulombiennes sont importantes. lorsque forces de répulsion coulombiennes > tension superficielle il y a explosion de la gouttelette en une gouttelette plus petite Au delà d’un certaine limite appelée limite/diamètre de Rayleigh, on observe une fission des gouttelettes en gouttelettes de plus petites taille. Après plusieurs étapes de fissions/explosions, la densité de charge dans la gouttelette devient telle que le champ électrique local très intense conduit à le désorption des ions par effet de champ. Il se forme alors des ions solvatés constitués de l’ion analyte entouré de molécules de solvant et de nombreuses charges. L’évaporation des dernières molécules de solvant permet d’obtenir un ion désolvaté contenant n charges, i.e. nH+ : on parle d’ions multichargés

L’ionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité ………… Débit de la pompe Débit du spray L’électrospray est concentration – dépendant Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la sensibilité. L’intensité du courant d’ions produit dépend de la concentration de la solution et non pas du débit auquel la solution est injectée Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible possible

L’ionisation électrospray : débit élevés et débits faibles ………… Débit de la pompe Débit du spray Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de solution apporté par la pompe. DEBITS ELEVES (1 - 200 microlitres par minute) En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute) Plus l’orifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible. Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il n’est même plus nécessaire de pousser avec une pompe; l’aspiration électrostatique suffit à assurer le débit (nano spray)

Capillaire d’environ 100 microns L’ionisation électrospray : pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la nébulisation (1 à 200 microlitres /min.) Débit de la pompe ………… Débit de la pompe Capillaire d’environ 100 microns de diamètre intérieur Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. ………… Flux d’azote comprimé Des gouttelettes sont arrachées à la surface du cône de liquide.

Le système de "canne" d'introduction ESI Extrémité de canne d'introduction MICROMASS, montrant le capillaire en quartz qui amène le solution (75 microns de diamètre intérieur). Le gaz de nébulisation(azote) est améné de façon concentrique par le tube en métal. La tension de 3 à 4000 volts est appliquée sur le métal. Le tube de quartz ne doit dépasser que de 0,5mm.

Le système de "canne" d'introduction ESI

L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min. Débit de la pompe ………… (Nano LC-MS) Débit du spray: de 0,1 à 1 µL/min MICRO SPRAY : capillaire de faible diamètre (20 à 75 microns) …….………… Débit du spray: de 1 à 200 nanoL/min NANO-SPRAY : selon Mann et al. Orifice réduit (1 à 3 microns) 1 - 4 mm D’autres nano-systèmes automatisés permettent des débits de quelques nano-litres par minutes (Advion,…)

L’ESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min. Capillaire nanospray vide E trop faible E spray instable E correct spray stable

Des puces microfluidiques de nanoES : ESI Chip™(Advion) Features 400 identical microfabricated nozzles Integrated grounded silicon electrode provides a high, uniform electric field equivalent to a 2-mm pulled capillary 19

Avec une source ESI, l'analyseur peut être: Un quadrupôle Le moins cher et le plus facile Une trappe d'ions MS-MS facile et pas cher Un temps de vol Meilleure résolution qu'un quadrupôle Un appareil magnétique Difficile et cher, mais 20000 de résolution Un FT-ICR Cher, difficile et lent, mais très haute résolution

Avantages de l’électrospray - fonctionne à basse T°C, à pression atmosphérique, donc peu d ’énergie interne communiquée aux ions pas de dégradation, les liaisons covalentes ne sont pas rompues - mesure précise de la masse moléculaire (0.1%) soit ± 1 Da sur M = 10000 Da - permet d ’extraire des ions de large masse moléculaire (polymère, biomolécule) - sensible (C  mM) - permet d’extraire des molécules polaires Inconvénients de l’électrospray - fournit peu d’information sur la structure, sauf si on effectue de la MS/MS - très sensible à la présence de sels ou additifs suppression du signal dessalage impératif

Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS Le signal en ES est très sensible à la présence, même à faible concentration, d’agents contaminants tels que : les sels inorganiques (Na, K, etc…) > 1mM les tampons non volatils (Tris, CHAPS, HEPES, phosphates, citrates, etc…) les surfactants et les détergents (SDS, Triton, Tween, NP40, etc…) > 0.05% les agents chaotropes (urée, sels de guanidine, etc…) les solvants non volatils (glycérol, etc…)

k : efficacité d’ionisation Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS - Phénomène de compétition à l’ionisation : la présence de ces agents induits une suppression de l’analyte kA [A+] I mes A = I kA [A+] + kB [B+] Courant ionique produit en source Courant mesuré pour A k : efficacité d’ionisation - Formation d’adduits pour les contaminants faiblement volatils - Neutralisation de la charge portée par l’analyte (ex : SDS) - Modification de la tension de surface de la solution (détergents, glycérol)

Effet d’agents contaminants pour l’analyse par ES-MS (HEPES)2 Ncp7 (10 M) dans un tampon HEPES 238 Da Na+ + HEPES Na+ + HEPES Na+ + HEPES Ncp7 (10 M) dans H2O

L’ionisation par électrospray permet la mesure de masse de molécules très grosses. Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions multichargés. Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z élevée. La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses monoisotopiques.

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES On se sert des profils isotopiques z charges 500.5 m/z 100 % 501.5 502.5 m/z Dm/z=1 La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da donc le rapport m/z varie de 1/z Si z=1 Dm/z=1 z=2 Dm/z=0.5 z=3 Dm/z=0.33 etc

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES Entre 2 isotopes, m/z = 1 13C 15N 12C 1H 16O 14N 35Cl 79Br 500.5 501.5 18O 37Cl 81Br 502.5 m/z Dm/z=1 Si z=1 alors au niveau du profil isotopique Dm/z=1/1 = 1 z=2 Dm/z=1/2 = 0.5 z=3 Dm/z=1/3 = 0.33 etc …..

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES 500.0 501.0 502.0 m/z Dm/z=1 Ici Dm/z= 1 : on en déduit que ce pic est 1x chargé (monochargé) On en déduit la masse monoisotopique du composé M= (500.0x1) – 1 = 499 Da

Comment déterminer l’état de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES 500.0 500.5 501.0 m/z Dm/z=0.5 Ici Dm/z= 0.5 : on en déduit que ce pic est 2x chargé (dichargé) On en déduit la masse monoisotopique du composé M= (500.0x2) – 2 = 998 Da

Spectre ESI d’un peptide de masse monoisotopique 1340,6 Da avec résolution isotopique sur les ions à une et deux charges Massif isotopique Dichargé (différence de 0,5 m/z) Massif isotopique monochargé [M + 2H] 2+ [M + H] +

La détection du profil isotopique dépend de la résolution de l’analyseur (Ex de la myoglobine) 17+ On mesure la masse monoisotopique R = 30000 Si réso Si pas de réso R = 2000 On mesure la masse moyenne

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: L'ESI génère des ions multichargés La masse M et le nombre de charge z sont d’abord calculés à partir de 2 pics. Ensuite, M est calculée à partir de chacun des pics de la série d’ions multichagés. Dans cet exemple on observe 15 états de charges différents (10 à 24 charges). La masse mesurée sera donc le résultat de la moyenne de ces 13 mesures, d’où la grande précision obtenue. A: 16951.47 ± 0.28 Da Série d’ions multichargés. Tous ces pics correspondent à la même molécule, mais avec un nombre de protons différents.

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut d’abord déterminer les valeurs de z m/z X1 X2 Deux pics consécutifs permettent de déterminer M et Z1 A: 16951.47 ± 0.28 Da z2 = z1 - 1 X1 = M + z1 mH z1 X2 = M + z2 mH z2 Système de 2 équations à 2 inconnues X2 - 1 Calcul de Z: z1 = X2 - X1

Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut d’abord déterminer les valeurs de z X1 X2 A: 16951.47 ± 0.28 Da X1 = M + z1 z1 X2 = M + z2 z2 = 893.205 = 942.742 X2 - 1 942.742 - 1 19.01 z1 = 19 Calcul de Z: z1 = = = X2 - X1 942.742 – 893.205

Calcul de la masse moléculaire de la myoglobine à partir de la série d’ions multichargés du spectre ESI m/z z Masse 679,12 25 16953,00 707,31 24 16951,44 737,99 23 16950,77 721,5 22 15851,00 808,28 21 16952,88 848,53 20 16950,60 893,24 19 16952,56 942,67 18 16950,06 998,18 17 16952,06 1060,41 16 16950,56 1130,95 15 16949,25 1211,81 14 16951,34 Moyenne : 16951,65 +/- 0,17 Da Une fois que les valeurs de z sont déterminées (en résolvant le système d’équation à 2 inconnues M et z), la masse moléculaire de la protéine est recalculée à partir de chaque pic. La moyenne des valeurs trouvées pour la masse moléculaire est calculée avec une déviation standard. Plus il y a d’ions multichargés, plus la masse pourra être mesurée avec précision Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques

L’ionisation ESI est compatible avec une introduction directe ou par chromatographie de l’échantillon Source Interface Analyseur Introduction de l ’échantillon: - direct (infusion) - couplage LC Obtention d ’ions en phase gazeuse Focalisation et transmission des ions Séparation des ions en fonction du rapport m/z

Collecte des pics Edman Le couplage LC-MS : avec ou sans split Diviseur SM HPLC rp Détecteur UV Collecte des pics Edman 4 5 6 7 8 9 1 2 3 % A . B A: 1410.2 0.4 B: 972.9 0.2 m/z 1 . 7 5 Trace UV 1 Spectre 6 . 6 3 % 4 3 . 1 3 2 4 . 7 3 3 1 . 8 5 1 8 . 4 3 3 7 . 8 5 4 5 . 9 8 5 1 . 1 6 5 8 . 6 9 4 1 . 2 6 3 . 9 7 1 . 7 5 1 Chromatogramme d’ions 2 5 . 8 5 3 3 . 5 8 Mesure de la masse moléculaire de chaque pic élué % 3 7 . 8 5 4 6 . 8 5 1 . 1 6 3 . 2 2 1 . 3 8 4 1 . 3 5 8 . 6 9 6 2 . 1 4 1 5 . 8 9 5 4 . 1 1 7 1 . 4 Time 1 . 2 . 3 . 4 . 5 . 6 . 7 .

Exemples d’instruments ES-MS ou ES-MS/MS nanoESI-TOF (Waters) with Triversa nanomate (Advion) ESI-Q-TOF II (Waters) ESI-Q-TOF Synapt with IMS (Waters) ESI-Q-TOF (Bruker)

Applications en ESI-MS  Vérification de structure et de pureté de molécules naturelles ou synthétiques  Contrôle du suivi d’une molécule au cours du temps  Détection et identification de modification  Couplage LC-MS  Complexes non covalents  Informations structurales par MSMS

A retenir à propos de l’ionisation par électrospray (ESI): 1- L’ESI permet de mesurer des masses très élevées par ce qu’elle génére des ions multichargés (plusieurs millions de Daltons). 2- L’ESI est très douce. On observe que les ions moléculaires qui ne fragmentent pas. 3- L’ESI permet l’analyse des petites molécules et les massifs isotopiques permettent de déterminer l’état de charge des différents ions. 4- L’ESI est compatible avec le couplage LC-MS