II- Biochimie des substances d’origine animale (2) Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA Biochimie appliquée II- Biochimie des substances d’origine animale (2) Préparé par: Mr. HALLA Noureddine

Culture de cellules animales (eucaryotes): L'hybridation cellulaire - application à la production d'anticorps monoclonaux

Antigène Protéine Anticorps Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Introduction Antigène Protéine Anticorps

assurant sa destruction. Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Introduction Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction. Utilisation en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique.

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Historique Georges Köhler et César Milstein: la technique d’obtention des anticorps monoclonaux 1975 1984 Ac monoclonaux chimériques souris/homme 1986 premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3) 1989 Ac monoclonaux humanisés 1994 production d’Ac monoclonaux humains par des souris transgéniques ou transchromosomiques Présent Plusieurs progressions

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Définition Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes). Ils reconnaissent un type unique de site antigénique, Ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux. Ils sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Rappel Lorsque les immunoglobulines lient une molécule ou une particule virale ou bactérienne, les immunoglobulines sont toutes désignées sous le nom d’anticorps, et l’entité reconnue est appelée antigène. Anticorps Deux propriétés : - capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose, sécrétion d’amines …) Caractérisation L’Ac joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire : - c’est le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en solution dans le sérum, - c’est le transmetteur ou l’activateur de signaux physiologiques. Rôles

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Rappel Structure

La technique des hybridomes Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps monoclonaux La technique des hybridomes la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

Déroulement de la production des hybridomes Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes Déroulement de la production des hybridomes sélection des hybridomes test des hybridomes fusion des cellules obtention des cellules production des hybridomes isolement des hybridomes

+ Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 1 Obtention des cellules Utilisation de cellules myélomateuses HGPRT Immunisation de la souris avec l’antigène étudié Obtention des lymphocytes spécifiques Obtention des cellules immortelles Fusion +

+ Par méthode chimique Par méthode physique Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 2 Fusion des cellules Par méthode chimique Par méthode physique sélection fusion des membranes cellulaires avec poly éthylène glycol fusion des membranes cellulaires par électroporation +

+ Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 3 Sélection des hybridomes Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine) Cellule myélomateuse HGPRT- Lymphocyte B MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser MORT CELLULAIRE disparition après quelques divisions HYBRIDOME SELECTIONNE +

+ Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 4 Isolement des hybridomes Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré (transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule : +

+ Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 4 Isolement des hybridomes Sur milieu gélosé Par dilution limite Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit +

+ Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 5 Test des hybridomes Test sur le surnageant de chaque puits de la présence des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA du type d’anticorps produit par des méthodes d’immunoprécipitation +

Amplification des hybridomes Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes 6 Production des ACM Production par cultures cellulaires Amplification des hybridomes obtention des anticorps monoclonaux Production dans les liquides d'ascites Conservation des hybridomes +

La technique des hybridomes Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production La technique des hybridomes AMP HGPRT Hypoxanthine IMP Azasérine GMP Aminoptérine Synthèse endogène Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine Milieu Haza : Hypoxanthine, azasérine Aminoptérine Thymidine TMP Thymidine Kinase

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV Il s’agit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur d’un anticorps donné en y introduisant le virus d’Epstein-Barr EBV. L’EBV possède la propriété remarquable d’induire la prolifération continue des lymphocytes B infectés.

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV Le virus est un membre de la famille des herpès virus. Il infecte 90 % à 95 % des adultes. Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt.

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Production la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV Les lymphocytes sécréteurs d’un anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des autres éléments figurés du sang sur gradient de densité 1.077. Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles.

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Applications Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour l’immunomarquage des leucémies aigues. la compréhension de nombreux processus biologiques. Pour distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires. la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse. D’une façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique. Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.