Service d’Histologie, Biologie de la Reproduction La spermatogenèse Jean Pierre Siffroi Service d’Histologie, Biologie de la Reproduction et Cytogénétique Hôpital Tenon jean-pierre.siffroi@tnn.aphp.fr

1) Données embryologiques - Origine des cellules germinales 2) Méïose - Evolution des cellules germinales 2) Méïose - Généralités et différences entre méïoses mâle et femelle - Phases de la méïose: aspects cytologiques, chromosomiques et génétiques 3) Spermatogenèse - Spermatogonies - Spermatocytes - Spermiogenèse 4) Spermatozoïde 5) Cinétique de la spermatogenèse - Cycle de l’épithélium séminal 5) Régulation de la spermatogenèse - Régulation endocrine - Régulation paracrine 6) Eléments de spermiologie

Embryologie Origine des cellules germinales Dans les deux sexes, les cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells: PGCs) apparaissent dans la paroi postérieure de la vésicule vitelline et MIGRENT vers la région du mésonephros (rein intermédiaire) pour former les crêtes génitales: future gonade primitive indifférenciée Vésicule vitelline PGCs Intestin postérieur Intestin antérieur Coeur Cloaque Mésonephros Crêtes génitales Intestin

Embryologie Evolution des cellules germinales Dans le sexe mâle, la différenciation de la gonade primitive en testicule aboutit à la formation de tubes séminifères primitifs (PGCs et cellules de Sertoli) dans lesquels les PGCs vont bloquer leur maturation au stade de futures cellules souches de la spermatogenèse PUBERTE Reprise de la maturation des cellules germinales Spermatogenèse ou production de gamètes matures continue tout au long de la vie

L’évènement le plus important dans la différenciation des cellules germinales est la MEÏOSE

Méïose + M2 M1 Généralités Fondamentalement, la méïose est un processus aboutissant à la production des gamètes ou cellules haploïdes ne contenant que la moitié (n) du stock diploïde (2n) de chromosomes, c’est-à-dire un chromosome de chaque paire Succession de 2 divisions cellulaires: M1 réductionnelle M1 M2 équationnelle M2 +

un phénomène complexe analysable sur 3 aspects La méïose: un phénomène complexe analysable sur 3 aspects différents mais étroitement liés Aspect cytologique: les différentes phases de la méïose Aspect chromosomique: appariement et ségrégation des chromosomes Aspect génétique: les recombinaisons et le brassage des gènes

Méïose Différences entre méïoses mâles et femelles Le déroulement de la méïose est très différent selon le sexe dans le temps PGC Migration Invasion de la gonade primitive SRY Testicule Blocage des cellules en phase pré-méïotique: pro-spermatogonies Méïose à la puberté Ovaire Début de la méïose au stade foetal Blocage avant la naissance en fin de prophase de M1: follicule primordial Reprise de la méïose à la puberté

Méïose Sexe femelle Sexe mâle Différences entre méïoses mâles et femelles Le déroulement de la méïose est très différent selon le sexe dans la répartition du cytoplasme Sexe mâle Sexe femelle Globules polaires

Comme pour toute division cellulaire, les divisions méïotiques Méïose Aspects cytologiques Différences mitose-méïose Comme pour toute division cellulaire, les divisions méïotiques comportent une prophase, une métaphase, une anaphase et une télophase mais de nombreuses différences existent! la durée Mitose: quelques dizaines de minutes Méïose: - plus de 20j pour la prophase de M1 chez l’homme - plusieurs années chez la femme (prophase bloquée)

l’appariement des chromosomes homologues et leurs recombinaisons MITOSE MEÏOSE l’appariement des chromosomes homologues et leurs recombinaisons la non-séparation des chromatides sœurs en M1 = la ségrégation de chaque homologue dans des cellules filles différentes

l’absence de nouvelle synthèse d’ADN entre la M1 et la M2 - normalement une phase S précède toute mitose - la M2 suit la M1 sans nouvelle phase S l’activité génique - les gènes ne sont pas transcrits pendant la mitose - il existe une transcription intense au stade pachytène (sauf X-Y chez l’homme)

Les phases clefs de la méïose sont: - la prophase de M1 avec ses 5 stades . leptotène . zygotène . pachytène . diplotène . diacinèse - et l’anaphase de M1 LEZYPADIDI

Chromosomes dupliqués sous la forme de filaments irréguliers Rapprochement des homologues Duplication et début de migration des centrioles

Début de l’appariement des chromosomes homologues ou synapsis Migration des centrioles aux pôles opposés de la cellule

Phase la plus longue de la prophase (16j chez l’homme) Synapsis complet: les chromosomes sont sous forme de bivalents Corpuscule XY (Vésicule sexuelle VS) chez le mâle (chromosomes X et Y inactivés)

le complexe synaptonémal L’appariement des chromosomes est réalisé grâce à une structure en fermeture éclair: le complexe synaptonémal dont les éléments latéraux intègrent des structures pré-existantes du squelette des chromosomes: des protéines de la famille des SMCs (Structural Maintenance of Chromosomes) dont la protéine Rec8 (Cohesin) Eléments latéraux Elément central Filaments transverses

Rec8

L’appariement des chromosomes homologues permet, de plus, la survenue des recombinaisons génétiques et le brassage des allèles parentaux dans les gamètes De nouvelles combinaisons de gènes sont ainsi « essayées » à chaque génération et soumises à la sélection naturelle

Les recombinaisons génétiques surviennent au niveau des chiasmas (Crossing over)

Condensation accrue des chromosomes Les bivalents ont tendance à se dissocier sauf aux endroits des recombinaisons: chiasmas (nombre, position) Disparition des éléments du CS Disparition du corpuscule XY Interruption de la MI féminine à ce stade

Condensation maximale des chromosomes Fin de la prophase de MI Condensation maximale des chromosomes toujours reliés entre eux au niveau des chiasmas « Glissement ou terminalisation des chiasmas » Disparition de l’enveloppe nucléaire

Sous l’effet des forces égales exercées par les microtubules du fuseau de division, les chromosomes se disposent sur la plaque équatoriale MAIS

Contrairement à la mitose où le fuseau est bi-polaire et où les chromatides sœurs vont être libérées par une séparase Séparase

En méïose, le fuseau de division en M1 est uni-polaire (accrochage des microtubules sur un seul côté grâce au complexe Monopolin ou Mam1) Rec8 La protéine Rec8 passe d’une localisation axiale le long des chromosomes à une localisation centromérique

à un pôle différent de la cellule ce qui aboutit, en anaphase, à la ségrégation de chaque chromosome homologue à un pôle différent de la cellule et à la non séparation des chromatides soeurs

De plus, cette ségrégation concerne des chromosomes « chimères » car ayant réalisé des recombinaisons au stade pachytène

223 combinaisons pour l’ensemble du génome En anaphase 1, la ségrégation des chromosomes non homologues se fait de façon aléatoire = indépendance des caractères héréditaires (gènes) portés par des chromosomes différents A B A B 223 combinaisons pour l’ensemble du génome

L’enveloppe nucléaire se reconstitue autour de deux lots de chromosomes contenant un chromosome de chaque paire sous la forme de deux chromatides sœurs reliées entre elles au niveau du centromère

La M2 est une division cellulaire plus classique comportant les phases habituelles d’une mitose mais: - qui suit la M1 sans nouvelle phase S de synthèse d’ADN - qui comprend la séparation des chromatides sœurs (disparition de Rec8) - qui aboutit à la production de gamètes haploïdes (une chromatide de chaque paire chromosomique par cellule et recombinée)

sont reconnaissables dans la lignée germinale mâle, Spermatogenèse Processus de multiplication et de différenciation cellulaires qui, après la puberté, aboutit à la production de spermatozoïdes à partir de cellules souches Cellules de Sertoli Spermatides Spermatocytes Spermatogonies Leydig Gaine péritubulaire Dure 74j chez l’homme 3 types de cellules sont reconnaissables dans la lignée germinale mâle, correspondant chacun à une étape précise: - les spermatogonies: divisions mitotiques les spermatocytes: méïose - les spermatides: différenciation terminale ou spermiogenèse

Les spermatogonies sont localisées à la périphérie des tubes séminifères, près de la membrane basale et entre les cellules de Sertoli 3 types en microscopie photonique: - spermatogonies Ad (dark): noyau arrondi avec une chromatine fine et très colorable - spermatogonies Ap (pale): noyau ovalaire - spermatogonies B: noyau arrondi et foncé avec une chromatine en amas (Spermatogonies croutelleuses) cellules de réserve

donnent directement naissance aux spermatocytes I Les spermatogonies B donnent directement naissance aux spermatocytes I grandes cellules ovalaires situées à distance de la membrane basale qui rentrent en méïose Le stade le plus visible sur coupes est le stade pachytène qui est le plus long (bivalents bien individualisés)

Le passage en méïose s’accompagne également d’un passage des cellules germinales du compartiment basal au compartiment adluminal des tubes séminifères au stade leptotène précoce: Jonctions serrées des jonctions serrées situées entre les cellules de Sertoli s’ouvrent, laissent passer les cellules germinales et se reconstituent derrière Compartiment adluminal basal Constitution de la barrière hémato-testiculaire comprenant: - l’endothélium des capillaires - les cellules péritubulaires - la membrane basale des tubes - les jonctions serrées entre Sertoli les cellules germinales post-méïotiques sont isolées du système immunitaire

Spermatides et spermiogenèse Les spermatocytes II, qui effectuent la M2, se transforment directement en spermatides cellules haploïdes qui vont subir une différenciation radicale, la spermiogenèse, (il n’y a plus de division cellulaire) pour se transformer en spermatozoïdes 3 familles de spermatides: - spermatides jeunes ou rondes - spermatides intermédiaires ou en cours d’élongation spermatides matures ou allongées divisées en 8 stades chez l’homme

Les modifications des spermatides portent sur: - la formation de l’acrosome - les remaniements nucléaires - le développement du flagelle - la réorganisation du cytoplasme

Formation de l’acrosome Des vacuoles issues de l’appareil de Golgi et renfermant des granules pro-acrosomiaux fusionnent pour former la vésicule acrosomale qui se développe à un pôle du noyau (futur pôle antérieur) A fur et à mesure de son développement, la vésicule acrosomale finit par coiffer les 2/3 antérieurs du noyau et constitue l’acrosome dans lequel s’accumulent des enzymes provenant de l’appareil de Golgi

Remaniements nucléaires Les deux évènements principaux concernant le noyau sont: - l’élongation la condensation du génome et ont lieu dans la deuxième moitié de la spermiogenèse L’élongation est due à l’accrochage de microtubules constituant la manchette à l’enveloppe nucléaire. Ils disparaissent dans les stades tardifs de la spermiogenèse La condensation est due au remplacement des histones de type somatique par des protéines nucléaires plus basiques: les protamines

Développement du flagelle Débute dès les premiers stades de la spermiogenèse par le déplacement des deux centrioles au pôle postérieur du noyau (opposé à la vésicule acrosomiale) Photo JL Courtens Disposition en T caractéristique Le flagelle se développe à partir du centriole distal qui assemble les éléments de l’axonème

Microtubule B (10-11 protofilaments) Microtubule A (13 protofilaments) Doublet central Bras externe de dynéine Bras interne Lien de nexine Pont radiaire Tête radiaire Gaine fibreuse

Réorganisation du cytoplasme Glissement du cytoplasme vers l’arrière, le long du flagelle en cours de formation Diminution de volume du cytoplasme: formation des corps résiduels qui seront phagocytés par les cellules de Sertoli Disposition des mitochondries autour de la partie initiale du flagelle jusqu’à une zone d’étranglement: l’annulus

Spermatozoïde Le spermatozoïde est le gamète mâle mature libéré dans la lumière des tubes séminifères et transporté tout au long du tractus génital C’est une cellule mobile capable d’atteindre le gamète femelle dans les voies génitales féminines Schématiquement, il se résume à: - un noyau contenant le génome haploïde mâle - un appareil propulseur: le flagelle - du carburant: les mitochondries

1,5 à 3µ 3 à 4,5µ 60µ Acrosome Tête Noyau Cape post-acrosomale Pièce intermédiaire Annulus principale Pièce terminale Noyau Cape post-acrosomale Espace nucléaire postérieur Plaque basale Colonnes segmentées Centriole proximal Mitochondries Fibres denses Gaine fibreuse Axonème Colonne longitudinale Tête Col 60µ 3 à 4,5µ 1,5 à 3µ

Cinétique de la spermatogenèse L’observation, en coupe transversale, des tubes séminifères montre qu’ils n’ont pas tous le même aspect = pas la même composition en cellules germinales de différents types 6 associations préférentielles de cellules germinales entre elles sont observables chez l’homme, définissant les 6 stades de l’épithélium séminal Ces stades sont dus à une entrée en mitose cyclique et régulière des spermatogonies associée à une durée d’existence variable de chaque type cellulaire pendant la spermatogenèse

18j 9j 23j 1j Durée de vie variable de chaque type de cellules germinales Entrée périodique des spermatogonies en division tous les 16 jours

74j Cycle spermatogénétique = 74j ~ 4 cycles et demi de l’épithélium séminal 23j 1j 23j 9j 18j Chacun des 6 stades se répète tous les 16j = durée du cycle de l’épithélium séminal

Régulation endocrine de la spermatogenèse Système nerveux central Hypothalamus Environnement: lumière, stress, olfaction, ….. Hypophyse GnRH Gonadotrophin Releasing Hormone - Testostérone - Leydig Testicule Sertoli FSH + Gonadotrophines Leydig LH + et LH + - Inhibine Activine

hypothalamo-hypohysaire Hypogonadisme hypogonadotrope Système nerveux central Hypothalamus Anomalie de l’axe hypothalamo-hypohysaire + - Inhibine Activine Testostérone Hypophyse Testicule Sertoli Leydig FSH LH ± Gonadotrophines FSH et/ou LH basses

Hypogonadisme hypergonadotrope Système nerveux central Hypothalamus Axe hypothalamo- hypohysaire normal + - Inhibine Activine Hypophyse Testostérone - LH ++ FSH ++ Gonadotrophines FSH ou LH élevées Testicule Sertoli Spermatogenèse déficiente: causes toxiques, environnementales, chromosomiques ou idiopathiques Leydig Exemple: mutation du récepteur à la LH

Régulation paracrine de la spermatogenèse Interactions cellules péritubulaires – Sertoli Testostérone IGF1 + TGFβ - Interactions Leydig - Sertoli ABP P-Mod-S Protein Modulating Sertoli Spermatozoïdes Spermatides allongées Spermatides intermédiaires Spermatides rondes Spermatocytes Cellules de Sertoli Spermatogonies Membrane basale Cellules péritubulaires Capillaires Cellules de Leydig

Régulation paracrine de la spermatogenèse Interactions cellules germinales – Sertoli Spermatozoïdes Spermatides allongées IL1, IL6 Spermatides intermédiaires EGF NGF Spermatides rondes Spermatocytes Cellules de Sertoli Spermatogonies Membrane basale Cellules péritubulaires Capillaires Cellules de Leydig

Eléments de spermiologie 15% des couples consultent pour des difficultés à procréer! Dans 1/3 des cas, l’homme est seul responsable - Infertilité obstructive: production de spz normale mais tractus bouché (malformations, infections) - Infertilité non obstructive: atteinte de la spermatogenèse Spermogramme - Azoospermie: pas de spz (≠ d’aspermie: pas d’éjaculat) - Oligozoospermie: diminution du nombre de spz (< 20 millions/ml) - Asthénozoospermie: diminution de la mobilité

tératozoospermie: augmentation des formes anormales Spermocytogramme tératozoospermie: augmentation des formes anormales - Têtes - Flagelles Même chez les hommes normospermiques, il existe une grande variabilité des chiffres du spermogramme selon les moments: nécessité de répéter les examens

Toujours rechercher une cause scientifique (et donc pouvoir éventuellement proposer un traitement) à une infertilité de couple!