Pharmacologie Moléculaire 2 Magali Waelbroeck mawaelbr@ulb.ac.be E1.6.207

But du cours: Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi l’expérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer. 43 SLIDES

Moyens: Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique. Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions… 43 SLIDES

Outils utilisés dans ce cours: Programmes: Graph Pad: utilisation et interprétation des données expérimentales ou simulées. Commentaires: voir http://www.graphpad.com/index.cfm?cmd=library.index Spdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le “tutorial” de Gale Rhodes http://www.usm.maine.edu/~rhodes/SPVTut/index.html Excell: simulation de résultats attendus 43 SLIDES

Voici quatre représentations d’une même protéine Voici quatre représentations d’une même protéine. Sur lesquelles peut on voir: Le tracé de la chaine polypeptidique? Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure? Le volume occupé réellement par la protéine? Les chaines latérales des acides aminés? Le type d’acide aminé (Basique, acide, hdrophobe, polaire)? La structure primaire? Secondaire? Tertiaire? Quaternaire? La position du ou des ligands? 43 SLIDES

A B D C 43 SLIDES

Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques? Définition du terme “affinité” Qu’est-ce qui permet ou explique une liaison de forte affinité? Définition du terme “spécificité” Pourquoi dit-on qu’un enzyme, un récepteur, un ligand est très spécifique de… Définition du terme “cinétique” Qu’est-ce qui explique une liaison rapide ou lente? Une dissociation rapide ou lente? 43 SLIDES

Thermodynamique: Energie Libre R+D R.D Chemin réactionnel 43 SLIDES

Thermodynamique: Energie Libre R+D R.D Chemin réactionnel 43 SLIDES

Collisions: Phase aqueuse, T° pièce : Collisions: 1010 M-1sec-1 ≈1011M-1min-1 Protéines: peu de collisions productives: kon typiques: petites molécules: 106-108 M-1min-1 protéine-protéine: 105 M-1min-1 43 SLIDES

Relations vitesse - affinité? Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteur Vitesse association constante, Dissociation lente  haute affinité; dissociation rapide  basse affinité KD proportionnelle à koff 43 SLIDES

Vérification: mesure du kon de différents couples ligand - récepteurs Trop petits: pas visibles. Échelle log? 43 SLIDES

kon : comparaison de différents ligands, différents récepteurs 3 logs: 1000 x Conclusion: kon très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi? 43 SLIDES

Premier indice: comparaison de la vitesse d’association d’énantiomères R β-adrenergique kon (108M-1min-1) koff (min-1) pKD t1/2 (min) (-) pindolol 6.9 0.546 9.10 1.27 (+) pindolol 6.6 18.97 7.54 0.4 (-)CGP 12177 2.2 0.024 9.97 28.9 (+)CGP 12177 4.2 0.57 7.86 0.12 (-)ICYP 14.0 0.0025 11.75 277.3 (+)ICYP 17.0 0.488 9.54 1.4 (-)carazolol 7.4 11.47 277 (+)carasolol 3.4 0.085 9.6 8.2 (-)IHYP 11.0 0.0021 11.72 330 (+)IHYP 5.8 0.042 10.14 16.5 43 SLIDES

kon koff pKD t1/2 (min) (108M-1min-1) (min-1) Muscarinique (M2) (R)-QNB 1.0 0.0092 10.0 75 (S)-QNB 1.1 0.6 8.3 1.2 (R)-Met QNB 2.6 0.11 9.4 6.3 (S)-Met QNB 5.8 0.25 2.8 Muscarinique (M3) <<0.0009 <<10.0 >>360 0.10 8.0 0.23 0.015 9.2 46 0.50 0.2 8.4 3.5 43 SLIDES

Données à expliquer: kon dépend (un peu) du ligand, kon dépend (beaucoup) du récepteur, kon presque identique si énantiomères, koff détermine l’affinité relative des énantiomères… 43 SLIDES

Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium   Steven K. Drake and Joseph J. Falke* Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309-0215 Biochemistry, 35 (6), 1753 -1760, 1996.   Abstract: In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca2+ binding and dissociation. 43 SLIDES

Galactose Binding Protein: Ca2+ Galactose 43 SLIDES

Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F ») « index » Ca+2 « pouce » Asp Lys (groupe C=O chaine polypeptidique) Asp Asn Ca+2 Asn « paume » 43 SLIDES

To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain. 43 SLIDES

Galactose binding protein: Calcium binding site Calcium binding E-F Hand (gate closed) Calcium binding E-F Hand (gate open) « Gate » « Gate » Gln « gate keeper » Gln « gate keeper » 43 SLIDES

Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb3+, used as a probe metal ion. 43 SLIDES

Fluorescence? Lumière = Énergie: 1 Einstein = 1 mol de photons 1 kcal = 4,1868 kJ 43 SLIDES

Rappel: orbitales liantes et antiliantes ( ou  ) 1* 1p 1p * Energie 1 2* 2s 2s * 2 43 SLIDES

Fluorescence, phosphorescence Fluorescence: réémission de lumière immédiate; Phosphorescence: isomérisation du spin des e-: réémission lente. 43 SLIDES

FRET Excitation - - - - Emission ________ Donneur Accepteur λ (nm) L’énergie dégagée par le donneur est absorbée directement par l’accepteur, puis réémise sous forme de photons de plus longue λ 43 SLIDES

3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à 10-20 Å du Tb3+ Terbium (donneur) phosphorescent 3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à 10-20 Å du Tb3+ 43 SLIDES

“GATE”: KD (µM) koff (sec-1) kon (µM-1sec-1) Glutamate: 0.06 0.0002 -CH2-CH2-COO- 0.06 0.0002 0.003 Aspartate: -CH2-COO- 0.13 0.0019 0.014 Glutamine-(wt) -CH2-CH2-CONH2 2.00 0.0064 Serine: -CH2OH 0.80 0.6500 0.810 Threonine: -CHOH-CH3 2.30 0.9100 0.400 Asparagine: -CH2-CONH2 1.90 1.0200 0.540 Glycine: -H 1.40 2.0000 1.430 Alanine: -CH3 2.80 3.7900 1.350 43 SLIDES

Q S,T D N,G,A Q E Liaison Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ association dissociation E Energie Libre Q S,T N,G,A Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ Chemin réactionnel Chemin réactionnel 43 SLIDES

Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les expressions suivantes? Le ligand reconnaît le récepteur. L’agoniste reconnaît le récepteur, qui s’active (laisse passer les ions Na+, Ca2+, ou Cl- ) Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent l’ouverture du canal Cl- L’agoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Pourrait-il favoriser la formation d’un complexe de basse affinité? Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. 43 SLIDES

Rappel: Liaison à un site: L’association du radioligand : Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation: A l’équilibre, les deux réactions se compensent exactement : 43 SLIDES

Cinétique de dissociation: Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée: Sur une échelle log: Sur une échelle linéaire: -koff 43 SLIDES

Cinétique d’association (1): La réaction d’association: Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément: 43 SLIDES

Cinétique d’association : (2) Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant: R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: kobs=konF+koff 43 SLIDES

Cinétique d’association : (3) Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente? 43 SLIDES

Cinétique d’association : (4) linéarisation 43 SLIDES

Cinétique d’association : (5) évaluation de kon, koff La “constante de vitesse d’association” apparente, kobs, augmente proportionnellement à F koff kon 43 SLIDES

Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le récepteur? 43 SLIDES

Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapide 43 SLIDES

Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et compétiteur très rapide 43 SLIDES

Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lent 43 SLIDES

Cinétique de liaison: traceur racémique 43 SLIDES

Il suffit que k-2 soit <<k-1… Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. Il suffit que k-2 soit <<k-1… 43 SLIDES