Anaïs Brassier Interne de pédiatrie Paris Master 2 de génétique Acidurie propionique (AP): déficit énergétique secondaire et essai de traitements anaplérotiques Anaïs Brassier Interne de pédiatrie Paris Master 2 de génétique Hôpital Necker Enfants Malades Inserm Unité 781 Y. De Keyzer; P.de Lonlay; A.Munnich

Introduction: acidurie propionique (1) Maladie rare d’intoxication endogène Maladie du catabolisme des acides aminés ramifiés de transmission autosomique récessive Liée à un déficit enzymatique en propionyl CoA carboxylase (PCC) Bloc enzymatique sur la voie de dégradation de 4 acides aminés essentiels (valine, isoleucine, méthionine, thréonine)

Introduction: acidurie propionique (2) La PCC convertit le propionyl CoA en méthylmalonyl CoA puis transformation en succinyl CoA qui rejoint le cycle de Krebs (CK) Principal but du CK: synthèse de NADH utilisé par la chaîne respiratoire mitochondriale (CR) Cycle de Krebs

Clinique: Forme typique (déficit enzymatique complet): révélation néonatale par un coma progressif avec acido- cétose et hyperammoniémie Décès rapide en l’absence de traitement Formes plus tardives (déficit enzymatique partiel): présentations neurodigestives très variables Formes rares d’AP sensibles à la biotine (B8: cofacteur de la PCC)

Biologie: Non spécifiques: Spécifiques: Acidose métabolique à TA augmenté Cétose Hyperlactacidémie Hyperammoniémie Spécifiques: CAO urinaire: accumulation de métabolites toxiques en amont du déficit (3 OH propionate, tiglyglycine, méthylcitrate, et propionylglycine) Diagnostic de certitude = diagnostic moléculaire: recherche du déficit enzymatique par séquençage de l’ADN (sur sang ou fibroblastes)

Complications: Complications viscérales à long terme fréquentes et graves: Myocardiopathies Insuffisance rénale Pancréatite Complications neurologiques: nécrose aigüe des noyaux gris centraux (Sd de Leigh); syndrome cérebelleux; régression psychomotrice, mouvements anormaux et convulsions

Pronostic Pronostic à long terme difficile et incertain: morbidité et mortalité élevées Rôle toxique connu du propionyl CoA sur certaines enzymes mitochondriales Complications neurologiques tardives survenant même en cas de contrôle des précurseurs du propionate (régime hypoprotidique suivi limitant l’apport des précurseurs de l’acide propionique) autre mécanisme physiopathologique…

Mécanismes des complications mécanismes mal élucidés, mais probablement liés à un dysfonctionnement énergétique mitochondrial: Une accumulation de métabolites toxiques en amont du bloc enzymatique Un déficit en succinyl CoA en aval du bloc enzymatique Cycle de Krebs

Hypothèse: Le succinyl CoA est un substrat anaplérotique important du CK, impliqué directement dans la synthèse de NADH Donc: en cas de déficit en succinyl CoA Dysfonctionnement du CK Et déficit secondaire de la CR mitochondriale Hypothèse: augmenter les réserves de substrats anaplérotiques pour restaurer en partie l’acitivité du CK et le fonctionnement de la CR afin de prévenir les complications tardives de l’AP

But du master: Étudier l’efficacité de traitements anaplérotiques in vitro en contournant la voie du propionate pour restaurer l’activité de la CR Création d’un modèle de cellules hépatocytaires humaines (HepG2) rendues déficientes en PCCA (pas de lignées d’hépatocytes de patients atteints d’AP et le plus souvent les fibroblastes n’expriment pas le déficit enzymatique) par l’expression de RNAi spécifiques du gène

Methodes (1) construction du modèle synthèse de 4 RNAi ciblant plusieurs régions spécifiques des ARN m de la PCCA (logiciel internet) replacés dans oligonudléotide de 97nt (comportant les motifs de la structure miRNA ) : miPCCA-F (22) miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA 97 nt amplification par PCR de ces oligonucléotides miPCCA-F (22) miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA EcoRI XhoI 130 nt Sous clonage des oligonucléotides contenant le RNAi dans un plasmide d’expression EcoR I Ligation Transformation TMP + TMP-miPCCA E. coli Xho I

Methodes (2): construction du modele Transfection des plasmides recombinants dans les cellules hepG2 Carte du vecteur Sélection des clones HepG2 contenant le plasmide ( par puromycine) avec la plus forte diminution d’expression de PCCA Promotor = CMV TRE = Tetracycline Responsive Element (Tet-On) Puromycine resistance (promotor pgk) Expression GFP (IRES)

Methodes (3) Inhibition de la PCCA: Traitement des clones par doxycycline (0,1 à & µg/ml pendant 15 jours): induction de l’expression des miRNA spécifiques de la PCCA ( système TETon) TRE pCMV Palindrome du microRNA pPGK puromycine IRES GFP miPCCA-F (22) miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA Hybridation ARNm => “inactivation” RNAi Micro RNA replié

Methodes (4) Caractérisation des clones au niveau protéique: analyse de la PPCA par Western Blot et par dosage de l’activité enzymatique (carboxylation du propionyl CoA avec du C14 et mesure du méthylmalonyl CoA C14 produit) Mesure de l’activité de la CR mitochondriale par des techniques de spectrophotométrie Traitements des clones avec la plus forte diminution d’expression de la PCCA, par des substrats anaplérotiques (citrate, aspartate…) pendant 48 à 96h Comparaison de l’activité de la CR avant et après les traitements anaplérotiques

resultats Sélection de clones stables contenant le plasmide par puromycine Validation du modèle hépatocytaire par 2 clones indépendants montrant une forte inhibition de la PPCA sous traitement par doxycycline associés à une activité enzymatique très faible ( activité résiduelle de 4 %) Puromycine Selection

Bibliographie Leonard J 1995, J Inherit Metab Dis 18:430-434 Mardach R, et al. 2005, Mol Genet Metab 85:286-90 Ostergaard E, et al. 2007, Brain 130:853-61 Schwab M, et al. 2006, Biochem J 398:107-12 Yano S, et al. 2003, J Inherit Metab Dis 26:481-8 Brusque M, et al. 2002, Neurochem Int 40:593-601 Alberio S, et al. 2007, Mitochondrion 7:6-12 Spinazzola A, et al. 2006, Nat Genet 38:570-5 Elpeleg O, et al. 2005, Am J Hum Genet 76:1081-6 Mochel F, et al. 2005, Mol Genet Metab 84:305-12 Roe C, et al. 2002, J Clin Invest 110:259-69

Merci de votre attention !!! citrate cis-aconitate isocitrate -ketoglutarate succincyl CoA succinate fumarate malate oxaloacétate acétyl CoA H2O CO2 + CO2 + Coenzyme A + CoA ADP FADH2 NADH ATP SDH Complexe II pyruvate glucose