I Le second signal parmi les grands paradigmes de l’immunologie

1°) clonalité de la réponse spécifique : régulations Ag par Ag I - Les grands principes classiques (1955 – 1980) 1°) clonalité de la réponse spécifique : régulations Ag par Ag Spécificité pré-établie Mémoire Persistance clonale Tolérance au soi Délétion clonale

2°)Transformation de l’Ag et présentation au TCR restreinte par le MHC T cell TCR CD3 B cell

TcR must recognize their epitopes in association with MHC molecules : The peptide bond model. Ag B cell BcR Primed B cell Endocytosis Ag digestion T epitopes Transfert on Class II Export to the membrane B epitopes Activ.T cell cooperation DC

: De l’immunité innée à l’immunité acquise Active oriente et attenue Mémoire spécifique protection Senseurs (multiples) recepteurs specifiques de l’Ag (mutation-selection) Variétés limitées mais Distribution clonale agresseur

agression Détection Identification de l’agresseur Elimination Immunité naturelle (immédiate) Immunité spécifique Tardif (>10j) Détection Identification de l’agresseur Protection et élimination Non spécifique Elimination (spécifique) de l’agresseur Réparations tissulaires

Présentation de l’antigène : les cellules dendritiques, migrations et activation tissus CD au repos CD en activation Pre – cellule dendritique Ganglion lymphatique Zone T Vaisseau sanguin

I - Les grands principes classiques (1955 – 1980)

Second signal , pools de cellules T et II Second signal , pools de cellules T et Aspects cinétiques de L’activation T

« Pools » des cellules T Cellules T Souches : de la M.O. au thymus, la colonisation Thy. corticaux (DP): sélection apprentissage du soi et constitution du répertoire Thy. Médullaires (SP): maturation et émigration, alimentation du répertoire T vierges périphériques : maintien de l’homéostasie ACTIVATION Réduction apoptotique T mémoires : effectrices et mémoires REACTIVATION 1° rencontre avec L’Ag Rencontres Succesives avec L’Ag

Critical threshold zone The first and second signals : a synergy Intra cell Ca ++ IL-2 production Cell cycling + CD28 Critical threshold zone - CD28 low high TCR occupancy

Two types of memory T cells virgin CD62L +++ CCR7 + CD29- 45RA-O+ Blood to lymph nodes Ag stimulation CD62L +++ CCR7+ CD29+++ 45RA+,RO- Central memory Stay in LN Ag stimulation CD62L - CCR7- CCR5, 4, 2 et 3 high CD29+++ 45RA+,RO- Goes to Inflammatory area Effector memory

Evènements cellulaires résultants de l’activation CD-CT III Evènements cellulaires résultants de l’activation CD-CT Rôles du second signal

L’activation des cellules T conduit à des états fonctionnels distincts II – Les molécules lymphocytaires et les mécanismes de la coopération ( 1980 - 1996) L’activation des cellules T conduit à des états fonctionnels distincts activation 2d signal Apoptose immédiate 1° signal Ag-CLII - TCR Cellule T vierge anergie

T cell functional polarization during activation II – Les molécules lymphocytaires et les mécanismes de la coopération ( 1980 - 1996) T cell functional polarization during activation TNFb IL-2 INFg TH1 IgG2a IL12 IL-27 2d signal THO intermediate states IgG1 IgGE Ig swich TH2 IL-4 IL5 IL3, IL13 IL-4

TH1 and TH17 lineages

T cell fate after Ag presentation

Cytokines & the T helper cell lineages

Après la rencontre CD - CT Follicule primaire CXCL13 TH2 CXCR5 TH2 Zone T T vierge TH1 CCR3 T Early Mem Vaisseau éfférent

PAMPs PRRs & T cell polarization III – la période contemporaine : le continuum des réactions inflammatoires, immunitaires innées et acquises (1996 - …) PAMPs PRRs & T cell polarization

The 3 signals model for T cell functional polarization

The « third » signal

IV les voies moléculaires du second signal : Multiples a)Les voies de la famille CD28/CD28-ligands b) Les voies de la famille TNF/TNF-R Aux effets variables Voies activatrices indispensables Voies activatrices accessoires Voies inhibitrices

The first act of T cell activation CD58 CD2 CD3 ZAP70 p56lck icam CD18

Formation of the T-cell Synapse

Activation complexes : II – Les molécules lymphocytaires et les mécanismes de la coopération ( 1980 - 1996) Cell cooperation And Supra Molecular Activation complexes : The Immunological synapse HIP-55 - ova - ova + ova CD43 WASP * overlay CMTMR * + ova SH3P7/HIP-55 localizes to the immunological synapse

Numerous surface molecules can deliver a second signal (i. e Numerous surface molecules can deliver a second signal (i.e. to complement a CD3 signal in the absence of accessory cells to get some degree of T cell acivation) Artifact or meaning ??

The molecular events : surface receptors & ligands First signals : Ag recognition and initiation of the synapse Coactivation signals : a) crucial signals CD28 – CD86/CD80 CD154 – CD4O ICOS – ICOSL CD100 – CD72

The CD28/B7 families of coreceptors Inhibitors / activators (Ig like superfamily) Receptor ligand CD28 CD86 CD80 CTLA-4 ICOS ICOS-L (B7RP1) PD1 PDL-1 PDL2 BTLA B7x TIM-3 ? Inhibitors / activators

The CD28 pathway as the prototype of the second signem Accessory cell T Cell CD28 CD86 CTLA-4 CD80

The CD28 prototypic second signal TCR 1st signal

? CD28 and ligands Akt PI3K Y Y APC T cell CD28 GRB2 CD80/B7.1 MYPPPY CD80/B7.1 ? Y APC GRB2 MYPPPY CD86/B7.2 T cell CD86/B7.2

Crystal structure of CTLA-4/B7.2 interaction (CD152/CD86) Iglike receptors of the CD28 family Crystal structure of CTLA-4/B7.2 interaction (CD152/CD86) CD86 T cell CD152 CD86 APC or B cell

Inhibitory pathways from CTLA-4 APC ITSM ITIM CTLA-4 MYPPPY Y Y MYPPPY SHP-2 CD80 T cell CD3 TCR CD86 SHIP SH2D1A CTLA-4 Y Y ITSM

The CD28/B7 families of coreceptors Inhibitors / activators (Ig like superfamily) Receptor ligand CD28 CD86 CD80 CTLA-4 ICOS ICOS-L (B7RP1) PD1 PDL-1 PDL2 BTLA B7x TIM-3 ? Inhibitors / activators

ICOS ICOS-L T cell The ICOS Pathway YY CD4OL PI3K Akt APC FDPPPF

ICOS-/- mice have + no GC + a low Ig production,part. IgE. Constitutive surf. Molecule Inducible surf. Molecule B7RP-1 Ag CD40 B7RP-1 CD86+CD80 CD28 ICOS Class II TcR Tc in GC CD40 CD154 CD28 CD40 CD154 1 2 3 CD86+CD80 ICOS TCR IL-4 & 13 Recept. IL4 & 13 B cell prolif & differentiation

The CD28 pathway induces another regulatory pathay: PD1/PDL1 & 2 CD28 PDL-1 PD1 PDL-2 PDL-1 PD1

T cell exhaustion during chronic viral infection

Reinvigorating Exhausted T Cells Freeman GJ JEM, sept 06 Resolved Infection Chronic Infection

The CD28/B7 families of coreceptors Inhibitors / activators (Ig like superfamily) Receptor ligand CD28 CD86 CD80 CTLA-4 ICOS ICOS-L (B7RP1) PD1 PDL-1 PDL2 BTLA B7x TIM-3 ? Inhibitors / activators

- + BTLA – BTx : an attenuator pathway for T & B cells BTLA & ICOS favour TH2 development in opposite way BTLA+++ ICOS- TH1 BTLA++ Naive T cell - BTLA++ BTLA- TH2 BTLA+- ICOS- + ICOS+++ T cell dependant in B cell help augmented in BTLA-/- mice (increasd B cell proliferation to BCR crosslink) BCR primed B cell Naive B cell B7x (ubiquitous) BTLA++ BTLA-

A model for a fine tuning of GC formation by the CD28-B7 pathways Coyle & Gutierez-Ramos Nat Immunol 4, 647, 2003 T cell Zone Ag Activating signals Inhibitory signals Naive B cell STOP B CD80/86 CD28+ CTLA-4+ B B7RP-1 ICOS B Primed Th PDL1/2 PD-1 Naive T cell B7x B BCLA CD28+ Primed Th Primed Th STOP

Crystal Structure of TNF and TNF Receptor

TNF-R signalling Pathways and T cell activation APC TNF member TNF-R signalling Pathways and T cell activation TNF-R member TRAF2 PI3K JNK T cell NF-KB AKT AP1 survival cytokines Cell cycling

Co-stimulatory members of the TNFR family

The TNF-R activ. Paths and second signals : A sustained and function. guided response Ag challange Ag challange T cell number & responses +TNF-R paths Critical threshold zone -TNF-R paths Primary response Secondary response Time

CD40 – CD154 The central pathway for T-B cooperation Activated Tcell CD154 (CD4OL) inducible CD40 signal B cell Increase adhesion And signal. mol. (CD80, 86, class II CD 95) IL-6, TNF, IL-10 & 12 LT, Ig, chemok. Proliferation Differentiation Germinal center Memory Bcells Isotype switching

The CD28 pathway is started by the CD40 pathway 6 5 7 CD86 2d signal CD3 TCR 1 4 1st signal CD4OL CD40 2 3

Prolonging and modulating B cell coactivation 1 : Once the CD40 and CD28 pathway fully works The CD134 (0X40) & 137 (4-BB1) pathways CXCR5 Help proliferation Ig switch CD134L CD134 Strong coactivation CD137L CD137 TCR CD28 CD4O CD154

Prolonging and modulating B cell coactivation 2 :Later on : Shaping the Immune response & setting long term memory TCR CD154 CD4O CD70 CD27 CD28 The CD27-CD70 pathway B subpopulation : Memory cells Terminal diff of B memory cells in plasma cells

Inhibition of neutralizing Antibodies By CD27 Stimulation After LCMV Infection

CD40 – CD40L and tumorogenesis

Controling and terminating B cell proliferation/activation 2 :Later control : inhibiting isotype switch : the CD30/CD153 pathway 3 : Ultimate B cell extinction : Apoptosis via CD95 TCR CD154 CD4O CD153 CD30 CD28 Controling and terminating B cell proliferation/activation CD95 CD95L

The BAFF / APRIL pathway is also important for T cell activation

Numerous surface molecules can deliver a second signal (i. e Numerous surface molecules can deliver a second signal (i.e. to complement a CD3 signal in the absence of accessory cells to get some degree of T cell acivation) Artifact or meaning ??

ICAM-3 - DC-SIGN Required for primaryT cell activation Resting virgin T cells LFA-1 ICAM-3 DC-SIGN (ICAM-3 Grabbing Non-integrin) 44 kDa Ctype lectin like distal domain (CA² depdt. Mannose binding) + 7 tandem repeat (23 residues) Identical to gp120 binding C lectin in placenta DC sign gene form a cluster with CD23 on 19p13 DC-SIGN Activated DC

Resting or activated endothelium DC-SIGN – ICAM-2 interaction mediates DC migration to peripheral and lymphoid tissues Blood flow DC-SIGN ICAM-2 Resting or activated endothelium tissue

DC-SIGN enhances trans – HIV Infection of T cells Mucosal epithelium T cell ICAM-3 Lymph node CD4 HIV DC-SIGN Circulating Activated DC

Integrin-associated protein (CD47) The Surface Receptor Group. INSERM U343, Hôpital de l'Archet, NICE Integrin-associated protein (CD47) 50 kDa plasma membrane glycoprotein Immunoglobulin superfamily member Ubiquitously expressed On T cells: Transduces a co-activation signal,distinct from CD28 (Ticchioni et al.) ; Induces immediate arrest on inflammed vascular Endothelium (Ticchioni et al.) induces apoptosis of activated T cells only (Pettersen et al.) Lindberg et al. J.Cell Biol. 1993 How & why a T cell receptor can induce so distinct & opposite fates ?

Criblage double hybride chez la levure : BNIP3 (E1B nineteen kDa interacting protein) 1 110 118 164 184 194 AA BH3-L TM Protéine ubiquiste de 21 kDa BNIP3 appartient à la famille Bcl-2, sous-famille BH3-only Membres anti-apoptotiques Bcl-2 Bcl-XL Mcl-1 Bcl-w A1/Bfl-1 BH4 BH3 BH1 BH2 TM BH3 TM Membres pro-apoptotiques Bax Bak Bok/Mtd Bcl-Xs Bik/Nbk Hrk/Dp5 Bim/Bod Bad Bid BNIP3 Nix Sous-famille BH3-only BH3-L BH1 BH2 BNIP3 est une molécule ubiquitaire de 21 kDa qui appartient à la famille Bcl-2. Cette famille se compose de membres anti-apoptotiques comme Bcl-2 ou Bcl-XL et de membres pro-apoptotiques. Ces derniers se divisent en deux groupes : la sous-famille Bax et la sous-famille des BH3-only à laquelle appartient BNIP3. Les membres de ce groupe ont pour caractéristique de ne posséder qu’un seul domaine d’homologie à Bcl-2, le domaine BH3. C'est le domaine qui permet les intéractions entre les membres pro- et anti-apoptotiques de la famille. Dans le cas de BNIP3, ce domaine est en partie tronqué et n'est pas fonctionnel. En réalité, c'est par sa partie N-terminale que BNIP3 est capable de s'associer à Bcl-2 et à Bcl-XL. Quant au domaine transmembranaire, il permet à BNIP3 de s'intégrer dans la membrane externe de la mitochondrie.

Une fraction du BNIP3 endogène se localise en membrane et dans le cytoplasme BNIP3 Mitochondries Superposition En fait, si on regarde la localisation du BNIP3 endogène, et on constate qu'il éxiste bien une fraction de BNIP3 à la membrane plasmique qui peut s'associer à CD47. Les deux molécules peuvent donc se rencontrer au niveau de la membrane plasmique. Maintenant, est-ce qu'elles peuvent intéragir ? C'est ce qu'on a voulu vérifier dans une deuxième série d'expériences. Cellules 293T Marquage du BNIP3 endogène

BNIP3 transloque de la membrane plasmique à la mitochondrie en réponse à l'engagement de CD47 - + CD47 mAb BNIP3 PLAP (Membrane plasmique) TOM40 (Mitochondrie) Fraction mitochondriale microsomale contrôle CD47 mAb BNIP3 Mito Superposition CD47 10µM En fait, on peut voir, grace à cette expérience de fractionnement subcellulaire, que l'engagement de CD47 conduit à la translocation de BNIP3 de la membrane plasmique à la mitochondrie. Ainsi, en conditions basales, une part de BNIP3 est détectée dans la fraction microsomale, constituée de la membrane plasmique et du cytosol. Après stimulation par CD47, la quantité de BNIP3 dans cette fraction diminue, alors qu'elle augmente dans la fraction mitochondriale. Je vous précise également que que pour des raisons techniques, la fraction mitochondriale est beaucoup plus concentrée que la fraction microsomale. La translocation est également visible en microscopie confocale, et vous voyez que sur des cellules au repos, BNIP3 est majoritairement localisé à la membrane plasmique et peu à la mitochondrie. Par contre, quand on active par CD47, BNIP3 acquiert alors un pattern mitochondrial.

? APOPTOSE CD47 Hypoxie Mitochondrie Ouverture Intégration du PT Pore Translocation de BNIP3 Mitochondrie Ouverture du PT Pore Altérations mitochondriales Suppression du potentiel de membrane APOPTOSE Intégration de BNIP3 Surexpression Hypoxie Greenberg et al Mol Cell Biol 2000 Richard K. Bruik PNAS 2000 HIF-1 Pour résumer, on pensait jusqu'à présent que seule l'hypoxie pouvait réguler l'apoptose induite par BNIP3. Dans ce modèle, le manque d'oxygène provoque la surexpression de BNIP3 qui s'intègre dans la membrane externe de la mitochondrie, entraîne l'ouverture de PT pore, et les altérations mitochondriales qui suivent aboutissent à l'apoptose de la cellule. Nous avons été les premiers à montrer que BNIP3 peut également être associé à une molécule de surface, CD47, et à la suite de son engagement, BNIP3 transloque à la mitochondrie et provoque la mort de la cellule. La question qui se pose alors est de savoir dans quelles circonsrances se fait l'engagement de CD47.

Thrombospondin-1 induces a rapid cell death via CD47 The Surface Receptor Group. INSERM U343, Hôpital de l'Archet, NICE Thrombospondin-1 induces a rapid cell death via CD47 In Jurkat cells CD47 ligands : Thrombospondin-1 : found in extracellular matrix and released in large amounts by activated platelets. Signal-regulatory protein (SIRPa1) : Expressed on the surface of macrophages, endothelial and dendritic cells. 94 3 9 73 17 1 2 95 22 43 34 Control Thrombospondin-1 SIRPa1-Fc CD47 mAb PI Annexin V In large amount: 100 µgml

APOPTOSE Inflammation CD47 TSP Hypoxie Mitochondrie Ouverture du PT Pore Altérations mitochondriales Suppression du potentiel de membrane APOPTOSE Intégration de BNIP3 Surexpression Hypoxie Greenberg et al Mol Cell Biol 2000 Richard K. Bruik PNAS 2000 HIF-1 CD47 Translocation Puisque les TSP-1 et –2 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales activées et la TSP-1 sécrétée en grande quantité par les plaquettes activées, il semblait possible que la voie apoptotique initiée par CD47 soit induite au cours de l'inflammation.

Inflammation or thrombosis apoptosis Circulating lymphocytes SIRP1a TSP-1

Modèle d'inflammation cutanée Oedèmes Infiltration de cellules mononucléées Thromboses vasculaires importantes Oxasolone sur l'oreille Challenge Oxasolone sur l'abdomen Sensibilisation Pour cela, nous avons utilisé un modèle inflammatoire qui correspond à une hypersensibilité retardée sur des souris sauvages ou déficientes pour CD47. Nous avons sensibilisé les souris en appliquant un haptène, l'oxasolone, au niveau de l'abdomène, et 5 jours plus tard, nous avons réappliqué cet hatène sur l'oreille. Il en résulte une réaction inflammatoire qui se caractérse par le développement d'œdèmes, une infiltration de cellules mononucléées dont le noyau est visible en noir, et des thromboses vasculaires importantes. Et ces conditions sont propices a l'augmentation de la quantité de TSP.

Inflammation is prolonged in CD47-deficient mice The Surface Receptor Group. INSERM U343, Hôpital de l'Archet, NICE Inflammation is prolonged in CD47-deficient mice 180 230 280 330 380 430 1 2 3 4 5 6 7 WT + oxa CD47 KO + oxa WT CD47 KO Days Ear swelling (µm) Challenge CD47 KO WT +oxa 24h +oxa 48h Co 10 20 30 40 50 2 Living T cells (%) CD47 KO WT + oxa 30h