Cryo-conservation : Congélation lente Congélation Rapide Vitrification

Cryo- conservation DOMAINE D’APPLICATION : EMBRYONS ZYGOTES (2pn) EMBRYONS PRECOCES MORULAE – BLASTOCYSTES SPERME TISSUS TESTICULAIRE OVOCYTES TISSUS OVARIEN

1 CONGELATION LENTE des Embryons Cryo- conservation 1 CONGELATION LENTE des Embryons

Cryo- conservation TRANSFERTS D’EMBRYONS CONGELÉS LES INDICATIONS Embryons surnuméraires Deuxième tentative de grossesse Utérus hypoplasique ou malformés (tr : 1 seul Embr.) Transfert différé - Endomètre inadéquat après stimulation ou hyperstimulation. - Maturation in vitro (MIV) Don

Cryo- conservation Maintenir le niveau « d’eau constitutionnelle » Eviter Les cristaux de glace dans le milieu de congélation (augmentation de l’osmolarité --> déshydratation Embryon Eviter Les cristaux de glace dans l’embryon (dommage collatéraux irreversible) Eviter les effets de solution (hypertonicité intra-cellulaire) pendant la congélation Maintenir le niveau « d’eau constitutionnelle »

Cryo- conservation COMMENT REPONDRE AUX IMPERATIFS ? 1 - Remplacer l’eau libre par un (ou des) cryoprotecteurs Le DMSO, le propanediol, le glycérol, l’éthylène glycol sucrose (protecteur extra cellulaire) 2 - Descendre en température jusqu’au point de surfusion et pratiquer un seeding à la bonne température (-6°C ou -7°C, selon les réactifs utilisés) --> passage de l’état liquide à l’état solide sans cristaux de glace 3 - Descendre doucement en température jusqu’à au moins - 45°C à raison de 0,3°C./mn

Cryo- conservation

Cryo- conservation Exemple d’appareil programmable Cryologic* CL 8800

Cryo- conservation

Cryo- conservation

Cryo- conservation

Cryo- conservation SOUDEUSES

Cryo- conservation LE SEEDING Importance de la température (stabilisée) : avant pendant et après le seeding Importance de la localisation (pas sur les embryons)

Cryo- conservation LE SEEDING Importance de la VITESSE* Refroidir auparavant Une barre en métal ou Des pinces chirurgicales ou Un coton sur baguette * Ne pas réchauffer la paillette pendant l’opération

Cryo-conservation DECONGELATION RAPIDE

Cryo- conservation Air ou Bain Marie

Cryo- conservation Transfert : TEC

Vitrification 2 CONGELATION RAPIDE VITRIFICATION

Vitrification - 0,3°C./mn 2.000°C/mn système fermé 20.000°C./mn système ouvert

Vitrification Conditions nécessaires pour la vitrification Vitrification Congélation lente Conc. En Cryo-protecteur Forte 5-7M. Faible : 1,5 M Exposition au CP. Courte (2-5 mn) Longue (10-15 mn) Equilibration du CP. Minimale et partielle Totale Pénétration du CP. Partielle Complète Déshydratation forte Faible Aspect vitrifiant avant refroidissement oui non

Vitrification ….. Application de la vitrification au Blastocyste : 1998 : Mukaida et Coll. 1999 : Lane et Coll. 2001 : Yokota et Coll. 2002 : Vanderzwalmen et Coll. ….. Application de la vitrification au Blastocyste : Avec comme principe : - De vitrifier le plus vite possible en plongeant Les blastocystes déshydratés directement dans N2 liquide. - D’utiliser des systémes OUVERT (hemiStraw) Non septique - De réchauffer très rapidement avant remise en culture et transfert. (moins de 2 secondes)

Vitrification Malgré de bons résultats : - UTILISATION de forte concentration de cryoprotecteurs demandant des manipulations chronométrées et très rapides - Possibilité de contamination ??? des embryons en contact direct avec l’azote liquide. (Virus, bactéries)…

Vitrification 2004 - 2006 Débats au Parlement européen puis prise de position sur les principes de congélation des cellules humaines: Recommandation d’utiliser des méthodes « aseptiques » S’opposant à la congélation utilisant des systèmes « ouverts »

Vitrification Un exemple : Vitrisafe* Haute sécurité

Vitrification Problèmes à résoudre : Utiliser Les systèmes fermés aseptiques : Vitrisafe, Cryotip, VHS ….Qui permettront de : - Descendre suffisemment vite en température. vitesse > 1500°C/mn (contre >15.000 syst. Ouvert) - Eviter la « formation de barriere de vapeur » (agitation) Conserver une vitesse de réchauffement très rapide. Facteur + important que la vitesse de refroidissement Selon les travaux de Scheffen et Coll (1986), Fahy (1987), Fahy et Coll. (2007),

Vitrification La Qualité de la vitrification dépend : De la conc. en cryoprotecteur et de l’utilité d’utiliser des bains de solutions non vitrifiantes avant de plonger les embryons dans la solution vitrifiante. Du contrôle des temps de manipulation et des procédures De le vitesse de vitrification et de réchauffement De la praticabilité des ensembles « plug-pailettes » utilisés De la qualité des Embyons à congeler

Vitrification

UTILISATION D’UN SYSTEME DE VITRIFICATION EN MODE ASEPTIQUE ® VITRISAFE

HEMI-STRAW, PLUG : Receptacle pour vitrification Grip d’extraction

Grip d’extraction du Vitrisafe HEMI-STRAW, PLUG : Extraction Grip d’extraction du Vitrisafe

2 - PREPARATION D’UNE PAILLETTE ASEPTIQUE soudure 1235XP2365GBD identification

1 - PRE-TRAITEMENT DES EMBRYONS PRÉ-INC. 1 ES 2 ES 3 ES KIT : VITRIFREEZE - FERTIPRO

2 - Dépôt du (ou des) embryons sur le Plug 3 - Introduction du plug dans la paillette H.S SOUDURE

VITRIFICATION A -196 °C Plonger en agitant 3 à 10 secondes immerger dans l’azote liquide

Extraction du plug - Réchauffement 1 - Maintenir la paillette dans l’azote En serrant le PLUG avec une pince à clamp 2 - Couper l’embout de la paillette 3 - Mettre l’extracteur sur le grip du plug 4 - Sortir rapidement la paillette et la plonger aussitôt dans le premier milieu de décongélation du kit de réchauffement de votre choix ( – de 2 sec.)

Réchauffement (suite) REMISE EN CULTURE DES EMBRYONS (ou OVOCYTES) CONTINUER LA PROCEDURE DE RECHAUFFEMENT EN SUIVANT LES INDICATIONS DU KIT UTILISE

La vitrification est utilisable pour : Les Zygotes à 2 PN (++) Les embryons J2-J3 (++++) (remise en culture pour contrôle de la Reprise de leur développement) Les Morula (+++) Les Blastocystes (+++) ( Contrrôle de la reprise du volume initial)

RESTAURATION DU BLASTOCYSTE APRES RECHAUFFEMENT Eclosion après remise en culture

Vitrification Blastocyste Après Réchauffement a = Bon b = dégénéré D’après Thomas Ebner et Coll a = Bon b = dégénéré Membrane Cellulaire Membrane Cellulaire Présente Absente

Vitrification des OVOCYTES

Vitrification des OVOCYTES Effets délétères possibles

Vitrification des OVOCYTES vitrification rapide le système ouvert donne de meilleurs résultats ! Réchauffement rapide puis mise en culture de 2 heures ou plus avant micro-injection

fivfrance .formation