INSERM Unité 576 - Hôpital de l’Archet, Nice Signalisation cellulaire dans les cellules lymphoïdes Archimed Mai 2009 Marcel Deckert INSERM Unité 576 - Hôpital de l’Archet, Nice

Signalisation cellulaire dans les cellules lymphoïdes Généralités sur les principaux mécanismes moléculaires de la signalisation 2) Exemple de l’activation des lymphocytes T par l’antigène 3) La signalisation en Immunopathologie

Comment transmettre des informations à l’intérieur d’une cellule ? Le réseau de transduction des signaux Comment transmettre des informations à l’intérieur d’une cellule ? - Les molécules informatives agissent en combinaison = Nb limité de molécules - Réponse à des séries complexes de stimuli=Reconnaissance d’un profil /Intégration - Peu de voies sont linéaires =contrôle simultané de nbx systèmes effecteurs - Architecture hautement connectée = Fiabilité du système

Comment les cellules communiquent-elles? Par l’intermédiaire de molécules liées à la membrane plasmique (les molécules d’adhérence) Par l’intermédiaire de molécules sécrétées -Radicaux libres gazeux (NO) -Molécules hydrophobes (stéroïdes,…) -Molécules hydrosolubles (peptides, protéines,…) Directement de cytoplasme à cytoplasme: (les jonctions communicantes de type gap)

Les différentes formes de communications via les molécules sécrétées (A) PARACRINE (B) AUTOCRINE (C) ENDOCRINE (D) SYNAPTIQUE

Les différents types de récepteurs Récepteurs intracellulaires Récepteurs de surface Structure et fonction très différentes mais mécanisme d’action similaire - Diffusion à travers la membrane plasmique - Fixation à des récepteurs intracellulaires - Activation du récepteur -Transcription de gène spécifique Molécules hydrophiles Molécules hydrophobes - AA et dérivés (glutamate, GABA,…) Hormones (noradrenaline) - Peptides neuromédiateurs - Protéines: glycoprotéines, lipoprotéines - Autres: lumière, odeurs - Hormones stéroïdes (Cortisol, H. sexuelles) - Hormones thyroïdiennes - Les rétinoïdes (lipides médiateurs du développement) - Vitamine D (contrôle du métabolisme du calcium)

3 grandes classes de récepteurs protéiques de surface

Le devenir d’une cellule dépend de l’intégration de différents signaux Les cellules spécialisées répondent sélectivement aux signaux cellulaires Une même molécule peut induire différentes réponses selon le type cellulaire @ Importance du type cellulaire cible et de son état de différenciation pour la spécificité de la réponse

Protéine Kinase Protéine Phosphatase Une étape-clé de la signalisation: la phosphorylation des protéines 1950: Krebs et Beavo : point de départ à la notion de signalisation Naissance du concept de second messager: [cAMP]i sous adrénaline et glucagon Protéine Kinase ATP Substrat Substrat - P ADP + Pi Protéine Phosphatase 1960s : la PKA: cible de l ’AMPc 1970s : découverte des protéines G: Hydrolyse du GTP lié = « signaling switch » (interupteur moléculaire) 1980s-1990s: Découverte des kinases associées à polyomavirus v-Src et v-Abl ou comment la phosphorylation sur tyrosine contrôle la croissance cellulaire. Exemple des RTK (récepteurs à activité tyrosine kinase) = Dimérisation des récepteurs induites par le ligand (Schlessinger, 1988) Notion de modules de signalisation (domaines SH2 et SH3/Pawson 1992) = Réseaux moléculaires

Deux grands types d’interrupteurs moléculaires Guanosines triphosphatases = GTPases = Protéines G se lient au GTP (forme active) et l’hydrolyse en GDP (inactive) Protéines kinases/phosphatases Ajoutent/enlèvent un Pi sur des protéines cibles spécifiques La plupart des voies de signalisation font intervenir à la fois des GTPases et des kinases

Phosphorylation des protéines =Modification post-traductionnelle la plus courante Effet de la phosphorylation - Interférence stérique avec le substrat - Changement de conformation - Création de site de liaison pour des protéines partenaires (domaines SH2 ou PTB)

Régulation des protéines kinases 1- La phosphorylation -Phosphorylation de la boucle d’activation au voisinage du site actif = Accès au substrat et Formation du site actif 2- Régulation de la liaison au substrat Auto-inhibition: Présence d’un peptide inhibiteur intrinsèque qui se fixe sur les sites de liaison au substrat et les bloque Régulation extrinsèque par des sous unités inhibitrices Ex: Des sous unités régulatrices (R) de la PKA l’inhibent en bloquant le site de liaison Régulation extrinsèque par des sous unités activatrices Ex: des cyclines qui se lient aux kinases dépendantes de la cycline (Cdk) spécifiques du cycle cellulaire et les activent 3- Ciblage - Bicouches lipidiques - Localisation intracellulaire 4- Phosphatases -Membranaires (Ex: CD45) - Cytoplasmiques (Ex: SHP1/2, CDC25A)

Les domaines protéiques d’interaction Spécificité et amplification de la réponse

Diversité des protéines G

Protéines G monomériques Expression des gènes & Cytosquelette (adhérence, motilité, morphologie) Expression des gènes Trafic vésicules Organisation des microtubules Transport nucléocytoplasmique Trafic vésicules

Protéines G monomériques « Commutateurs biologiques » GEF: guanine nucleotide exchange factors GAP: GTPase activating proteins GDI: Guanine nucleotide exchange inhibitors Régulation fine 1- Switch nucléotide 2- Modification lipidique & localisation 3- Expression génique (mRNA instable, tissus restreint, régulation transcriptionnelle)

Les seconds messagers Définition Petites molécules qui transportent les signaux à l’intérieur de la cellule Grande diversité chimique - Lipides hydrophobes confinés aux bicouches membranaires - Ion inorganique (Ca2+) - Nucléotides (AMPc, GMPc) - Gaz (NO) Effets modulés par - La concentration: une augmentation ou diminution suffit à transmettre le signal de la source à la cible - La vitesse ou la fréquence de fluctuation Leur concentration dépend - Balance entre synthèse et dégradation par enzymes spécifiques - Ouverture/Fermeture de canaux et pompes

Nucléotides cycliques Mode d’action Se lie de façon réversible à des protéines cibles spécifiques Régulation Synthèse / dégradation par des enzymes spécifiques Propriétés Diffuse librement dans tout le cytoplasme Cibles Protéines kinase, Canaux ioniques, Certains GEF

Autres seconds messagers: Calcium intracytoplasmique et lipides membranaires Activation de phospholipases C spécifiques des phosphatidylinositol 4,5 di-phosphates - PLC régulées par des Protéines G hétérotrimériques - PLC régulées par des Protéines Tyrosine Kinases Membrane Extracellulaire Cytoplasme PtdIns(4,5)P2 (PIP2) DAG OH P PLC PKC P InsP3 Ca2+ Récepteur aux InsP3 Reticulum Endoplasmique

La Phosphatidyl Inositol 3’ kinase (PI 3-kinase) Membrane Extracellulaire Cytoplasme PtdIns (4,5)P2 (PIP2) PtdIns (3,4,5)P3 (PIP3) P P PhosphoInositides membranaires PI 3-kinase P Ex: Récepteur au PDGF ( YMDM ) Y- P SH2 SH3 p110 p85 PIP2 PIP3 ( YVPM ) Akt / PKB PI 3-kinase GEFs Adaptateurs, …. Protéines à domaine PH

Ex: Récepteurs à 7 segments transmembranaires Récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimèriques R ligand R   E   GTP GDP   ATP AMP cyclique Ex: Récepteurs à 7 segments transmembranaires adrénaline thrombine G G  adrénergique PLC b Enzyme Adénylate cyclase 2nd messager AMPc DAG + InsP3 Effecteur PKA PKC + Calcium

Récepteurs à activité protéine tyrosine kinase ( récepteur à l’Insuline, l’EGF, le PDGF...) kinase R E kinase R E kinase R E ligand E P P P P GEFs Ca2+ P PLC  PI 3-K Petites GTPases Rho Petite GTPase Ras PKC PhosphoInositides membranaires Expression des gènes, Prolifération, Survie Métabolisme, Cytosquelette

Compartimentalisation (Ex Radeaux lipidiques) Transduction d’un signal extracellulaire Specificité des R Signal Compartimentalisation Membranaire (Ex Radeaux lipidiques) et Cytoplasmique Amplification Intégration Rétrocontrôles Réponses cellulaires Cytoplasme (Cytosquelette, organelles) Noyau (Transcription, Chromatine)

lors de l’activation lymphocytaire T Signalisation lors de l’activation lymphocytaire T

La théorie des 2 signaux 1 2 CPA Cellule T Reconnaissance CMH L’activation de la cellule T nécessite la reconnaissance par le TCR d’un peptide antigénique spécifique mais aussi la présence de signaux additionnels co-stimulateurs provenant de molécules dites accessoires (ex:CD28). En leur absence les cellules T deviennent anergiques ou déclenchent un processus apoptotique. Des récepteurs de surface inhibant l’activation de la cellule T sont également présents. La balance entre ces signaux activateurs et inhibiteurs détermine le devenir de la réponse immune. CPA Cellule T CYTOKINES (IL-2) 1 PROLIFÉRATION SURVIE Reconnaissance antigénique CMH TCR 2 DIFFÉRENCIATION B7 Costimulation CD28 ADHÉRENCE

La Synapse Immunologique Synapse T/B (Kupfer et coll. 1997)

g e e d z-z Complexe récepteur à l’antigène des cellules T TCR CD4 CD3 extracell TCR CD4 CD3 e g e d z-z Lck Fyn Immunoreceptor tyrosine-based activation motif = ITAM YxxI/L (x)6-8YxxI/L intracell Proteine Tyrosine kinases Lck et Fyn

PTKs de la famille Src (Lck et Fyn) Myr NH2 COOH SH3 SH2 KINASE Y P Tyr PxxP K ATP Site de localisation membranaire Région d’autorégulation (Csk) domaine catalytique

Activation de ZAP-70 par les ITAMs phosphorylés Lck PO4- ZAP-70 kinase CD4 TCR CD3 z-z e g d MHC/Ag ZAP-70: Zeta-associated protein at 70kDa SIGNAUX PTPase CD45 Protéines à domaines SH2 Adaptateurs Enzymes

CPA Cellule T MHC/peptide CD4 a b TCR/CD3 e d e g Fyn Lck ZAP-70 z z IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

APC Vav Cellule T MHC/peptide CD4 a b TCR/CD3 e d e g LAT Sos Fyn Grb2 Lck Cbl-b ZAP-70 z z AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav Cellule T Sos Fyn Grb2 Lck Cbl-b ZAP-70 z z AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b ZAP-70 z z AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 ZAP-70 z z AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 z z NFkB AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Relargage de Ca et activation de la calcineurine z z Ca2+ NFkB Calcineurine AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Relargage de Ca et activation de la calcineurine z z Ca2+ NFkB Calcineurine P NFATc NFAT AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine z z Ca2+ Raf NFkB Calcineurine P MEK1/2 NFATc NFAT Erk1/2 AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices Voie des MAP Kinases APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine P MEK1/2 NFATc NFAT Erk1/2 AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices Voie des MAP Kinases APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 Rho P Cdc42 MEK1/2 NFATc NFAT WASP Erk1/2 AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices Voie des MAP Kinases GTPases de la famille Rho APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 Rho P Cdc42 MEK1/2 GTPases de la famille Rho NFATc NFAT WASP Erk1/2 AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

Molécules adaptatrices Voie des MAP Kinases GTPases de la famille Rho APC Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 Rho P Cdc42 MEK1/2 GTPases de la famille Rho NFATc NFAT WASP Erk1/2 Polymérisation de l’actine F-actine Réorganisation du cytosquelette « Capping » du TCR et formation du SMAC AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

APC Molécules adaptatrices Vav Cellule T Vav Voie des MAP Kinases Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices a b TCR/CD3 e d e g LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 Rho P Cdc42 MEK1/2 GTPases de la famille Rho NFATc NFAT WASP Erk1/2 Polymérisation de l’actine F-actine Réorganisation du cytosquelette Réorganisation du cytosquelette « Capping » du TCR et formation du SMAC AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

APC Molécules adaptatrices Vav Cellule T Vav Voie(s) costimulatrice(s) Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices B7 a b TCR/CD3 e d e g CD28 LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Voie(s) costimulatrice(s) PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 MEKK Rho P Cdc42 MEK1/2 GTPases de la famille Rho NFATc NFAT SEK1/2 WASP Erk1/2 JNK/SAPK Polymérisation de l’actine F-actine Réorganisation du cytosquelette Réorganisation du cytosquelette « Capping » du TCR et formation du SMAC AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

APC Molécules adaptatrices Vav Cellule T Vav Voie(s) costimulatrice(s) Activation PLC et hydrolyse de phospholipides membranaires MHC/peptide CD4 Molécules adaptatrices B7 a b TCR/CD3 e d e g CD28 LAT Vav PIP2 Cellule T Sos Fyn Grb2 PLCg1 Lck Cbl-b DAG IP3 PKC ZAP-70 Voie(s) costimulatrice(s) PI3K Vav SLP-76 Ras Relargage de Ca et activation de la calcineurine Cbl-b Nck z z Ca2+ Voie des MAP Kinases Raf NFkB Calcineurine Rac1 MEKK Rho P Cdc42 MEK1/2 GTPases de la famille Rho NFATc NFAT SEK1/2 WASP Erk1/2 JNK/SAPK Polymérisation de l’actine F-actine Synthèse de cytokines, molécules de membrane, prolifération Réorganisation du cytosquelette Réorganisation du cytosquelette « Capping » du TCR et formation du SMAC AP1 IL-2 Jun Fos NFkB NFAT Activation et prolifération des cellules T

La signalisation en Immunopathologie

A B Ca2+ Calcineurine NFAT NFAT La Calcineurine (Ser/Thr phosphatase) est inhibée par des composés immunosuppresseurs Ca2+ Calmoduline A Cyclosporine A - Cyclophiline B FK506 -FKBP Calcineurine NFAT P NFAT

Severe combined immunodeficiencies = SCID # Lymphopénie et Réponses immunitaires (cellules T et B) affectées # 40 % des cas sont liés à des mutations héréditaires sur le chromosome X , 60 % des cas sont liés à des mutations sporadiques ou héréditaires sur les autosomes Cellule T IL-2 Prolifération Différenciation CD28 TCR Défaut d’expression de la chaine CD3g ou CD3e Défaut d’expression de la chaine IL-2 Rg Défaut dans la transmission des signaux de transduction ?

ZAP-70 Mutations chez les patients immunodéficients Sites de mutations chez les patients immunodéficients ZAP-70 SH2 Kinase 1 2 3 10 102 162 254 338 593 NH2 COOH Mutations chez les patients immunodéficients 1 - Protéine plus courte (aa C-ter 503) dû à une délétion de 13pb 2 - Substitution Ser518 en Arg dû à une mutation ponctuelle 3 - Insertion d’un tripeptide Leu-Glu-Lys dû à la création par une mutation ponctuelle d’un nouveau site de splicing D’après Hivroz et Fischer Current Biology 1994, Vol. 4 p732

KNOCK OUT DU GENE DE ZAP-70 chez la souris - Pas de lymphocytes dans le sang périphérique - Blocage sous une forme immature dans le thymus

Cellules T issues des patients SCID: Dosage des ions Ca2+ intracellulaires libérés lors d’une stimulation du récepteur T Les lymphocytes sont marquées avec une sonde fluorescente (Indo-1) qui émet à des longueurs d’onde différentes suivant si elle est sous forme libre ou liée aux ions Ca2+ . Les cellules sont stimulées par des anticorps anti-CD3 ou par un Ionophore calcique. Analyse en cytométrie de flux. D’après Chan et al. (1994) Science Vol. 264 p1599

Immunoblots réalisés sur des lysats de cellules T issues des patients SCID Western -blots Western-blot Anti-phosphotyrosine D’après Chan et al. (1994) Science Vol. 264 p1600

Inhibiteurs de la signalisation Protéine Tyrosine Kinases dans des modèles d’asthme Target Inhibitor Model Eosinophilia BAL fluid cytokine AHR Syk BAY Rat Reduced Reduced TNFa ND JAK3 WHI-P97 Mouse Reduced ND Reduced NF-kB ASO Mouse Reduced Reduced TNFa, IL4, IL5 Reduced EGFR AG-1478 Mouse Reduced ND Reduced PI3K LY294002 Mouse Reduced Reduced IL4, IL5, IL13 Reduced ERK U0126 Mouse Reduced Reduced IL4, IL5, IL13 Reduced P38 MAPKSB239063 Mouse Reduced Reduced IL4, IL5, IL13 Reduced (AHR, airway hyperresponsiveness; from Wong, Curr.Opin. Pharmacol. 2005)

Intérêts de l’étude de la signalisation en physiopathologie Conclusion Intérêts de l’étude de la signalisation en physiopathologie un nombre grandissant de pathologies humaines implique des mutations, surexpression ou dysfonctionnements de kinases, de phosphatases, de leurs substrats ou d’autres molécules de signalisation Ex: 18 gènes codant pour des Protéines Tyrosine Kinases ont été identifiés comme oncogènes dans des tumeurs humaines ou des rétrovirus transformants) A l’inverse les Phosphatases apparaissent comme des suppresseurs de tumeurs (Ex: PTEN mutée dans des cancers sporadiques et le syndrome de Cowden) Bons candidats pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques, pharmocologiques ou autres Ex: Herceptin mAb anti-Erb2R et cancer mammaire Gleevec (STI571) inhibiteur de Bcr-Abl (PTK) et LMC