Méthodes physico-chimiques L2 BBTE – 144EN006 Méthodes physico-chimiques Étude de biomolécules 1- Méthodes de fractionnement 2- Méthodes de caractérisation

Méthodes de caractérisation-1 Absorption moléculaire visible Interaction des photons de la source lumineuse avec les électrons des liaisons des molécules présentes dans l‘échantillon Energie des photons Différence d‘énergie correspondant à une transition possible entre deux niveaux énergetiques de la molécule

Méthodes de caractérisation Absorption moléculaire visible La substance n‘absorbe que certaines radiations d‘un faisceau polychromatique entre 400 et 800 nm Mesure de l‘absorbance Loi de BEER-LAMBERT I0 I1 A = log A = e × l × c e: coefficient d’extinction molaire (L.mol-1.cm-1) l: épaisseur de la solution traversée (cm) c: concentration molaire de l’échantillon (mol.L-1)

Méthodes de caractérisation Absorption moléculaire visible Notion de Transmittance Validité de loi de BEER-LAMBERT Monochromatisme du faisceau incident Concentration (<10-2 mol/L) Milieux non troubles et non fluorescents Applications Méthode directe de dosage Méthode de comparaison avec un étalon Méthode avec une gamme étalon I1 I0 A = -log T T = 4

Méthodes de caractérisation Absorption Ultra-Violette Radiations correspondant à des transitions entre des niveaux d‘énergie électronique En U.V, l’absorption d’un rayonnement se traduit par de nombreuses transitions d’énergie très voisines La nature du solvant, le pH de la solution, la température, les hautes concentrations électrolytiques et la présence de substances interférentes peuvent influencer les spectres d'absorption des composés Les longueurs d'ondes des pics d'absorption peuvent être corrélées avec les types de liaisons dans une molécule donnée Spectres à bandes larges Identification des groupes fonctionnels d‘une molécule

Méthodes de caractérisation Absorption Ultra-Violette Analyse de composés comportant des chromophores: Groupement d‘atomes responsable de la couleur d’une molécule Types de chromophores: Systèmes à liaisons p conjuguées (doubles liaisons) Propriété optique résultant d'une capacité à absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d’onde sont transmises ou diffusées Création d’un nuage électronique délocalisé entrant en résonance avec le rayonnement incident (Ex: b-Carotène)

Méthodes de caractérisation Absorption Ultra-Violette Analyse de composés comportant des chromophores: Groupement d‘atomes responsable de la couleur d’une molécule Types de chromophores: Systèmes à liaisons p conjuguées (doubles liaisons) Complexes organométalliques Applications: Analyses qualitatives et quantitatives possibles Propriété optique résultant d'une capacité à absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d’onde sont transmises ou diffusées Création d’un nuage électronique délocalisé entrant en résonance avec le rayonnement incident (Ex: b-Carotène) Chlorophylle, Hémoglobine

Méthodes de caractérisation Absorption Ultra-Violette Les spectres d’absorption des acides nucléiques présentent une bande d’absorption maximale autour de 260 nm (transitions π  π* dans les purines et pyrimidines) et un signal croissant à l < 220 nm)

Méthodes de caractérisation Absorption Ultra-Violette Appareillage:spectrophotomètre UV-visible

Méthodes de caractérisation-2 Absorption Infra-Rouge Radiations correspondant à des transitions entre des états de vibration de la molécule (exemple d’un CH2) Etirement symétrique Etirement Anti-symétrique Cisaillement Bascule Agitation Torsion

Méthodes de caractérisation Absorption Infra-Rouge Molécules diatomiques n'ont qu'une seule liaison qui peut être étirée Molécules plus complexes possèdent plusieurs liaisons: Les vibrations peuvent être conjuguées et conduire à des absorptions infrarouges spécifiques On détermine les raies d’absorption en mesurant la transmission du faisceau électromagnétique en fonction du nombre d’onde entre 650 et 4000 cm-1 Fréquences caractéristiques liées à des fonctions chimiques

radiation infrarouge variation énergie vibrationnelle molécule apparition d’une bande dans le spectre Mise en résonance des fréquences de vibration des liaisons dans un groupement fonctionnel position (cm-1) largeur intensité pic typique

La spectroscopie infrarouge est une méthode d’identification et de dosage non destructive Un spectre infrarouge donne information: sur la présence de certains groupements fonctionnels sur la structure d’une molécule (si on connait la formule brute) mais d’autres analyses sont nécessaires pour confirmer la structure d’un analyte

Interprétation spectre IR: d’abord repérer ou exclure présence pics caractéristiques regarder région gauche des groupements fonctionnels ne pas détailler la région droite des empreintes digitales considérer intensité, largeur, nombre d’onde des pics pour l’attribution suivre raisonnement logique pour déterminer structure moléculaire Rappel: un pic est du à la variation de l’élongation: stretching () ou aux déformations dans et hors du plan: bending ()

Méthodes de caractérisation Absorption Infra-Rouge Appareillage Applications: Analyse fonctionnelle (caractérisation de composés) Contrôles pollution véhicules motorisés (bandes CO2 et CO) Traitement des données Chambre Echantillon Interféromètre

Préparation de l’échantillon solide ou liquide en solution dans une cellule ou cellule cylindrique pour composés gazeux 2. gouttelette de liquide entre pastilles de NaCl = film (possibilité utilisation solvant anhydre ou dispersion échantillon dans huile peu absorbante en infrarouge = nujol, huile de paraffine) 16

3. solide dans des pastilles de KBr mortier moule presse à pastiller pastille de KBr + échantillon

Avant chaque mesure IR on fait le « background »: on fait le spectre de l’air, qui est mémorisé par l’appareil et soustrait au spectre de l’échantillon Raison: éliminer les pics donnés par les molécules présents dans l’air, (notamment CO2)

Exemple de l’interférence de la CO2 dans les spectres IR

ν exemple présentation données spectre IR Position de la bande (cm -1 ) Mode de la vibration Liaison concernée largeur intensité 3300 ν O-H large intense 2900 C-H (CH3) étroite 2000 C=C arom peu intense 1100 δ C-O Même chose pour écrire le spectre théorique d’un composé