Recombination, pseudorecombination and synergism of geminiviruses are determinant keys to the epidemic of severe cassava mosaic disease in Uganda J.S. Pita, V.N.Fondong, A.Sangaré, W.Otim-Nape, S.Ogwal and C.M.Fauquet Journal of General Virology, 2001

Mosaïque du manioc (CMD) Principale maladie causant des pertes importantes Répartition géographique: Afrique et Inde Symptomatologie : malformations, distorsions du limbe, couleur jaunâtre Transmission : dissémination des boutures, mouche blanche Moyens de lutte : sélection de boutures saines, insecticide Bemisia tabaci

Mosaïque du manioc (CMD) Agent causal : virus émergeant des plantes geminivirus 4 virus: ACMV(African Cassava mosaic Virus) EACMV/ICMV/SACMV Virus à ADN circulaire simple brin non enveloppé bipartite, encapsidé 2 segments A et B possédant une région commune CR à forte homologie: A = P réplication et encapsidation viral B = 2P jouant un rôle dans la dissémination du virus à travers la plante

Mosaïque du manioc (CMD) Épidémiologie : 1928 = 1 ère apparition de la CMD en Uganda 1933-1944 = sévères épidémies contrôlées 1988 = épidémie sévère progressant rapidement du nord vers le sud => famines Etude pcdte =>Corrélation entre la présence du nv virus recombinant ACMV+EACMV et la sévérité de l’épidémie

Objectif de l’étude Meilleur compréhension des dynamiques de l’épidémie A partir de l’observation des plantes récoltées ainsi que celles obtenues en serres et des résultats de PCR et de southern blot

Recueil d’échantillons 80 sites (sud ouest, centre et nord), 183 prélèvements avec symptômes sévères (90%) et bénins 9 cultivars Mouches blanches

1/Reproduction des symptômes dans un environnement contrôlé 70.5% de succès L’échec de la culture n’est pas lié à la sévérité des symptômes Seules les boutures développant les mêmes symptômes dans les 2 conditions de cultures sont conservées pour l’étude après 70 j Les symptômes ≠ de sensibilité selon les cultivars : 8 à 32% de mort léger Sévère

2/Caractérisation moléculaire des geminivirus par PCR Utilisation de primers permettant d’amplifier le gène codant pour CP Nv geminivirus EACMV-UG3 Pas d’infection par ICMV et SACMV en Uganda

3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADN Relation CMV/sévérité des symptômes Action synergique entre les 2 espèces de virus Sélection du cultivar Ebwanatereka pour la suite de l’étude Reproduction des symptômes chez N.benthamiana Extraction de sève puis inoculation à ≠ concentrations, contrôlée par PCR Selon le virus EACMV-UG2 et ACMV-UG, sévérité des symptômes ≠

3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADN Relation accumulation ADN/sévérité des symptômes Southern blot Il existe une relation positive entre l’accumulation d’ADN et la sévérité des symptômes EACMV-UG2/Mld ACMV-UG +EACMV-UG2 EACMV-UG2/Svr

4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison CP Séquences très proches Tous les EACMV-UG2 possèdent le même fragment recombinant provenant de ACMV DNA-A Grande homologie de Séquence pour chaque espèce

4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison Preuve que EACMV-UG3 provient d’une recombinaison Séquençage de ADN-B de EACMV-UG1 et -UG3 =>comparaison du % d’identité de BC1 et BV1 ACMV et EACMV = 2 espèces distincts BV1 a la plus grande variabilité entre les 2 espèces 97% d’homologie entre EACMV-UG1 et -UG3 BC1 BV1

4/Analyse des séquences d’ADN et comparaison % identité entre les CR de A et B 3 importants clusters EACMV, EACMV-UG3 et ACMV EACMV-UG2 et EACMV-UG3 = 60% d’homologie EACMV-UG3 provient d’une recombinaison avec une autre espèce

5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus du manioc Dans la collection de plantes PCR, primers spécifiques JSP 017 et JSP 018 =>ACMV DNA-B Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-UG2 DNA-A possèdent aussi ACMV DNA-B Primers spécifiques de EACMV-UG3 et UG1 Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-UG2 DNA-A possèdent aussi EACMV-UG3 DNA-B Dans la collection de mouches PCR, même primers Présence de ACMV et EACMV-UG2 Présence de mélanges =>transmission est non spécifique

5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus du manioc Inoculation par biolistique de clones de EACMV-UG2 et EACMV-UG3 EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B présents dans les mêmes champs malgré leur faible identité , EACMV-UG2 A pourrait répliquer EACMV-UG3 B ? Infectivité du pseudorecombinant Symptômes chez les plantes Southern blot, PCR =>Réplication Il existe un phénomène de pseudorecombination chez les geminivirus

6/Distribution géographique des geminivirus en Uganda EACMV-UG2/Svr DNA-A + EACMV-UG3 DNA-B (rouge) EACMV-UG2/Mld (jaune) ACMV-UG/Svr (bleu) ACMV+EACMV (orange) ACMV-UG/Mld (vert) EACMV-UG1 DNA-A +EACMV-UG3 DNA-B Région centrale et nord est EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B 24% possèdent aussi ACMV-UG A et B Symptômes svr+++ Région du Sud Kampala, bord du lac Victoria ACMV, sptm léger +++ Combinaison, sptm svr Masaka-Kasese Bunyangabu -Fort portal ACMV, sptm svr Fort portal ACMV, EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B, EACMV-UG1 A et B, sptm svr Kampala EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B, sptm varié

Discussion Confirmation de la présence de ACMV, EACMV-UG1 (non-recombinant) et UG2 et découverte de la présence d’un nv virus EACMV-UG3 Les symptômes observés dans les champs peuvent être reproduits en chambre de culture et chez N.Benthamiana Il existe une corrélation positive entre la sévérité des symptômes et l’accumulation d’ADN suggérant l’existence de souches plus ou moins virulente qui définissent des aires géographiques et explique comment l’épidémie s’est répandue ACMV /svr= régions montagneuse ACMV/Mld = rives du lac Victoria (zone non atteinte lors de l’enquête) EACMV-UG2/svr = partout, EACMV-UG2/Mld = poches PCR et séquençage confirment que EACMV-UG2 Mld et svr possèdent le même fragment recombinant de ACMV sans pour autant exprimer les mêmes symptômes(mutation de la souche?)

Discussion Les zones de contact entre les 2 ppaux virus montre que les infections mixtes proviennent de recombinaison Il existe un phénomène de pseudorecombinaison entre EACMV-UG2 A et ACMV –UG B L’intensité des symptômes peut être liée à une interaction synergique des 2 v ACMV et EACMV-UG2 s’expliquant par une plus grande accumulation d’ADN EACMV-UG3 est dû à une recombinaison interespèce Pseudorecombinant EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B est infectieux, le + fqt car s ’acc ds feuilles jeunes cible préférentielle de la mouche blanche. =>clé de l’épidémie car pseudorecombinants se répliquent +, s’acc + et entraînent des sptm +svr Transmission préférentielle de v recombinant expliquerait l’émergence de EACMV-UG2 et la EACMV-UG1 L’arrivée de EACMV-UG2 dans les zones où ACMV étaient prédominant=>action synergique, dvpmt de l’épidémie

Dynamiques de l’épidémie en Uganda Synergisme entre ACMV et EACMV acc en ADN et transmission Le fait que EACMV-UG2 soit recombinant expliquerait qu’il soit le + répandu mais existence de souche moins virulentes possédant la même recombinaison, mutations?sélection de ces souches par les agriculteurs? Existence de pseudorecombinants stables entre ADN-A et B des souches d’une même espèce ou d’une espèce différente augmentation des possibilités de survie et source de biodiversité Il faut pls événements pour provoquer une épidémie Etudes complémentaires pour une meilleur compréhension avec l’utilisation de clones maintenant disponibles