Comment modéliser l'interaction entre régulations métaboliques et régulations géniques ? L'exemple du métabolisme carboné chez E. coli Daniel Kahn, Hidde de Jong, Delphine Ropers, Hans Geiselmann, Jean-Charles Portais et Jean-Luc Gouzé

Problématique générale de la régulation Les régulations cellulaires comportent plusieurs niveaux Réseaux de régulation de gènes Régulations métaboliques Ces niveaux interagissent L’expression génique influe sur le métabolisme par les changements de concentration d’enzymes Réciproquement le métabolisme influe sur l’expression des gènes Existe-t-il une ‘logique’ de l’articulation des deux types de régulation ? Sont-ils interchangeables ou contraints ? Importance relative des composantes génique et métabolique Donner des exemples de questions biologiques. Prendre en compte l’effet du métabolisme sur la dynamique de l’expression génique

Analyse modulaire dite « hiérarchique » module 1 métabolisme module 2 protéines module 3 mRNA

La matrice de stoechiométrie Les réactions du réseau métabolique sont exprimées dans la matrice de stoechiométrie N, dont les colonnes contiennent les coefficients de stoechiométrie de chaque réaction Cette matrice reflète la structure du système L’équation d’évolution des concentrations x du système s’écrit alors simplement en fonction des vitesses v : Formalisme à la base de la Théorie du Contrôle Métabolique (MCT) dx / dt = N · v(x,p)

Analyse modulaire en MCT Kahn & Westerhoff (1991) J. Theoret. Biol. 153:255-285 Décomposer les matrices par blocs L’absence de flux de matière entre modules rend la matrice de stœchiométrie diagonale par blocs N = Cela permet le calcul explicite de l’effet des interactions entre niveaux sur le contrôle global On peut ainsi calculer l’effet d’un feed-back du métabolisme sur l’expression génique

MCT et analyse de la régulation Ce sont des sensibilités locales  uniquement les dynamiques locales au voisinage de l’état stationnaire Formalisme non adapté à la description de transitions abruptes Ne permet pas d’interpréter les transitoires entre états stationnaires éloignés

Modèle LPM de réseau génique de Jong et al. (2003) Bioinformatics 19:336-344 Modélisation par des fonctions en escalier: x s-(x, θ)  1 xa  a s-(xa , a2) s-(xb , b1 ) – a xa . xb  b s-(xa , a1) s-(xb , b2 ) – b xb x : protein concentration  ,  : rate constants  : threshold concentration b - B a A Systèmes différentiels linéaires par morceaux (LPM)

Graphe de changement d’états QS3 QS2 QS1 QS4 QS5 QS10 QS15 QS20 QS25 QS24 QS23 QS22 QS21 QS16 QS11 QS6 QS7 QS12 QS17 QS18 QS19 QS13 QS14 QS8 QS9 a1 maxa maxb a6  b1  b2 Contient les états d’équilibre (et les cycles éventuels) Simulation qualitative: chemins atteignables dans ce graphe à partir d’un état initial donné

Genetic Network Analyzer (GNA) de Jong et al. (2003) Bioinformatics 19:336-344 Environnement de simulation de dynamiques qualitatives

Articuler les régulations Modéliser conjointement les régulations métaboliques et géniques: Réduire et simplifier pour pouvoir abstraire un fonctionnement intelligible Développer une méthodologie de modélisation composite qui combine des approximations différentes adaptées aux deux types de régulation Mesurer les contributions respectives des deux types de régulation Forces et faiblesses du modèle du point de vue systémique (robustesse, sensibilité, homéostasie, adaptabilité…) Comprendre la logique biologique de la répartition entre les deux types de régulation

Système biologique Métabolisme carboné d’E. coli Glucose g6p 6pgl rb5p G6PDH PTSG 6pgl RPI rb5p RPE f6p PGI fbp PFK TAL gap ALD dhap TPI bpg GAPDH 2pg PGK 3pg PGM pep ENO oaa acoa mal pyr MAEb PPC PCK ODC icit akg suc glx IDH KGDH ICL CS MALS fum PYK PDH cit FBP GLPX PGL 6pg x5p e4p TKTB s7p r5p TKTA kdpg 6PGDH EDD EDA Gluconate GNTT gnt GNTK Mannose PTSM m6p MPI Ribose RIBT rib RIBK DeoxyRibose DEOT DEOK dr5p acetaldh Acetate succoa ACN STK SDH FUM MDH DEOA ALDHA ALDHB ADH PPS MAEa acp PTA ACK ACS Fructose TK f1p FBA PTSF ga POX Métabolisme carboné d’E. coli NADH,H+ NAD+ n1 (ADP+Pi) n1 ATP FADH2 FAD n2 (ADP+Pi) n2 ATP RESP1 RESP2 Pyruvate Acetate + CO2 n2 (ADP+Pi) n2 ATP POX ?

Diauxie glucose-acétate Transition bien caractérisée Implique des changements importants Au niveau métabolique Glycolyse vers gluconéogénèse Au niveau génique Interaction forte des deux niveaux Oh et al. (2002), J Biol Chem. 277(15):13175-83.

Modèle à base d’ODEs Bettenbrock et al. (2005), J. Biol. Chem., 281(5): 2578-2584 Modèle cinétique avec plusieurs dizaines d’équations et plus de 100 paramètres

Ropers et al. (2006), Biosystems 84:124-152 Modèle de régulation génique Ropers et al. (2006), Biosystems 84:124-152 rrn P1 P2 CRP crp cya CYA cAMP•CRP FIS TopA topA GyrAB P1-P4 P1-P’1 P gyrAB Signal (lack of carbon source) DNA supercoiling fis tRNA rRNA protein gene promoter

Modèle ‘benchmark’ Modèle de régulation entièrement spécifié par équations différentielles ordinaires (ODEs) Objet ‘expérimental’ pour tester différentes approches de réduction et d’approximation EcoCyc, RegulonDB, BRENDA Bettenbrock, Ropers

Quelle réduction, quelles approximations ? Décomposition du système en une composante lente (génique) et une composante rapide (métabolique)  sous-système rapide algébrique (hypothèse de quasi-stationnarité) Agrégation de variables Approximations des réponses fortement coopératives par des fonctions en escalier Différentes linéarisations des réponses métaboliques Comparaison des modèles réduits et/ou simplifiés avec le modèle complet à base d’ODEs Modèle approché composite

Modélisation de la diauxie glucose-acétate Evaluation du modèle par analyse des dynamiques qualitatives (model-checking) Identifiabilité des paramètres Estimation de paramètres du modèle simplifié sur la base de données expérimentales : métaboliques (concentrations, flux: RMN du 13C, IC-MS) Expression génique (activités enzymatiques, microarrays, gènes rapporteurs)

Volet expérimental Les prédictions les plus intéressantes du modèle seront vérifiées par construction de mutants appropriés : Au niveau des variables métaboliques Au niveau de la dynamique d’expression du système (rapporteurs fluorescents) Choix de la souche BW25113. Une collection de 4000 délétions de gène est disponible au Japon (Keio) Banque de fusions de Zaslaver Zaslaver et al. (2006), Nature Methods, 3(8): 623-628

Rôles respectifs des régulations Etude de la réponse métabolique dans le modèle lorsque les régulations géniques sont supprimées Evaluation de la contribution de la composante génique à la réponse métabolique «  Coefficients de régulation  »

Typologie des régulations ‘hierarchical’ metabolic mixed antagonistic

Bio-info du métabolisme dans HELIX Annotation, prédiction de réactions et de voies métaboliques Environnement Genostar d’exploration de génomes Système PRIAM d’identification d’enzymes Bases de données du métabolisme Base UniPathway de voies métaboliques Analyse structurale du métabolisme Analyse de l’évolution du métabolisme Modélisation des flux et de leur régulation -         annotation, identification de gènes codant pour les enzymes, prédiction de réactions et de voies métaboliques -         bases de données du métabolisme en rapport avec les informations sur les protéines, les gènes, les phénotypes et les réseaux de régulation -         analyse de la structure du métabolisme en relation avec ses fonctions -         analyse de l’évolution du métabolisme -         modélisation des flux et de leur régulation

Axes de collaboration INRA-HELIX Lactococcus lactis Département MICA M. Cocaign-Bousquet, INRA-INSA Toulouse P. Renault, Jouy Buchnera aphidicola Département SPE H. Charles, INRA-INSA Lyon Escherichia coli JC Portais, INRA-INSA Toulouse Modélisation des flux et de leur régulation Delphine Ropers, Hidde de Jong, Daniel Kahn Annotation, bases de données, analyse structurale MF Sagot, A Morgat, A Viari, E Coissac 1. Annotation, prédiction de réactions et de voies métaboliques Anne Morgat, Daniel Kahn, François Rechenmann Coordinateur proposé : Daniel Kahn  Axes méthodologiques :  Voies de recherche : - Développement de prédicteurs d’enzymes (dans la suite du projet PRIAM)   Systèmes : L. lactis, B. aphidicola, Bradyrhizobium ORS278 ? Frankia ?    2. Bases de données du métabolisme Anne Morgat, Eric Coissac, François Rechenmann Coordinateur proposé : Anne Morgat  Systèmes : L. lactis, B. aphidicola ?, E. coli ?  3. Analyse structurale du métabolisme Marie-France Sagot, Alain Viari Coordinateur proposé : Marie-France Sagot L. lactis, B. aphidicola, E. coli  4. Analyse de l’évolution du métabolisme Marie-France Sagot, Vincent Daubin, Daniel Kahn, Guy Perrière, Alain Viari Coordinateur proposé : Guy Perrière 5. Modélisation des flux et de leur régulation Delphine Ropers, Hans Geiselmann, Jean-Luc Gouzé, Hidde de Jong, Daniel Kahn Coordinateur proposé : Hidde de Jong Axes méthodologiques : Voies de recherche : L. lactis, E. coli

regulation coefficients Rossell et al. (2006), PNAS 103:2166-2171 ‘hierarchical’ ~ metabolic regulation coefficients

Préciser le rôle des régulations géniques On observe un panachage des différents types de régulation Le flux à travers une même étape peut être régulé de manière différente, selon l’état physiologique de la cellule Ce coefficient de régulation ‘génique’  ne prend pas en compte les changements d’expression des autres enzymes du système Donc le coefficient de régulation ‘métabolique’ dérive aussi indirectement de ces changements d’expression Les contributions génique et métabolique de la régulation ne sont donc pas entièrement séparées  utilité du modèle conjoint

La matrice de stoechiométrie   Les réactions du réseau métabolique sont exprimées dans la matrice de stoechiométrie N, dont les colonnes contiennent les coefficients de stoechiométrie de chaque réaction.   La matrice de stoechiométrie reflète la STRUCTURE du SYSTEME L’évolution du système s’écrit : dx / dt = N · v(x,p)

L’évolution du système s’écrit :   dx / dt = N · v(x,p) En termes de molarités indépendantes : dx = L · dx0 avec N = L · N0 dx0 / dt = N0 · v

La matrice d’ élasticité  D = dv / dx Les coefficients d’élasticité reflètent la SENSIBILITE des REACTIONS  dv = D · L · dx0 et le système différentiel est caractérisé par le Jacobien Á : Á = N0 · D · L  

Relations de sommation Ces relations classiques s’écrivent pour des coefficients de contrôle normalisés : Flux : Molarités :

Relations de sommation par blocs La somme des coefficients de contrôle est effectuée sur toutes les réactions d’un module m : pour j  m pour j  m  j Le contrôle global d’un module sur un autre est identiquement nul. L’analyse de la régulation nécessite de séparer les termes, par exemple les activités de synthèse, de modification et de dégradation.

Qualitative modeling and simulation Computer support indispensable for dynamical analysis of genetic regulatory networks: modeling and simulation precise and unambiguous description of network systematic derivation of behavior predictions Method for qualitative simulation of large and complex genetic regulatory networks Method exploits related work in a variety of domains: mathematical and theoretical biology qualitative reasoning about physical systems control theory and hybrid systems de Jong, Gouzé et al. (2004), Bull. Math. Biol., 66(2):301-340

Domains in phase space Phase space divided into domains by threshold planes Different types of domains: regulatory and switching domains Switching domains located on threshold plane(s) xb xa a1 maxa maxb a2  b1  b2 .

Analysis in regulatory domains In every regulatory domain D, system monotonically tends towards target equilibrium set  (D) maxb model in D1 : D1 xa  a– a xa . xb  b – b xb D3 xa  a– a xa . xb  – b xb model in D3 :  (D1)  {(a /a , b /b )}  (D1)  (D3)  (D3)  {(a /a , 0 )} xb  b2  b1 a1 a2 maxa xa xa  a s-(xa , a2) s-(xb , b1 ) – a xa . xb  b s-(xa , a1) s-(xb , b2 ) – b xb

Analysis in switching domains In every switching domain D, system either instantaneously traverses D, or tends towards target equilibrium set  (D) D and  (D) located in same threshold hyperplane xb xa  (D1)  (D3) D1 D3 D2 xb xa D5  (D5) D3  (D3) D4  (D4) Filippov generalization of PL differential equations Gouzé, Sari (2002), Dyn. Syst., 17(4):299-316

Qualitative state and state transition maxa maxb a2  b1  b2  (D1) D2 D3 QS3 QS2 QS1 D1 QS1   D1, {(1,1)}  Qualitative state is discrete abstraction, consisting of domain D and relative position of target equilibrium set  (D) Transition between qualitative states associated with D and D', if trajectory starting in D reaches D'

State transition graph D2 D3 D4 D7 D5 D6 D1 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D24 D20 D21 D22 D23 D19 D25 QS3 QS2 QS1 QS4 QS5 QS10 QS15 QS20 QS25 QS24 QS23 QS22 QS21 QS16 QS11 QS6 QS7 QS12 QS17 QS18 QS19 QS13 QS14 QS8 QS9 a1 maxa maxb a2  b1  b2 Closure of qualitative states and transitions between qualitative states results in state transition graph Transition graph contains qualitative equilibrium states and/or cycles

Robustness of state transition graph State transition graph, and hence qualitative dynamics, is dependent on parameter values a1 maxa maxb a2  b1  b2 a1 maxa maxb a2  b1  b2  (D1) D1  (D1) D2 D6 D7 QS6 QS2 QS1 QS7 QS6 QS1 D2 D6 D7 D1

Inequality constraints Same state transition graph obtained for two types of inequality constraints on parameters , , and  : Ordering of threshold concentrations of proteins 0 < a1 < a2 < maxa xb xa a1 maxa maxb a2  b1  b2 0 < b1 < b2 < maxb Ordering of target equilibrium values w.r.t. threshold concentrations a2 < ka / ga < maxa b2 < kb / gb < maxb maxa xb xa a1 maxb a2  b1  b2 a /ga kb /gb

Qualitative simulation PL model supplemented with inequality constraints results in qualitative PL model b1 maxb xb QS1 b2 QS2 QS3 QS 4 a1 maxa xa a2 a1 maxa maxb a6  b1  b2 D1 QS1 Given qualitative PL model, qualitative simulation determines all qualitative states that are reachable from initial state through successive transitions

Genetic Network Analyzer (GNA) Qualitative simulation method implemented in Java 1.4: Genetic Network Analyzer (GNA) Graphical interface to control simulation and analyze results de Jong et al. (2003), Bioinformatics, 19(3):336-344

Nutritional stress response in E. coli Response of E. coli to nutritional stress conditions controlled by network of global regulators of transcription Fis, Crp, H-NS, Lrp, RpoS,… Network only partially known and no global view of its functioning available Computational and experimental study directed at understanding of: How network controls gene expression to adapt cell to stress conditions How network evolves over time to adapt to environment Projects: inter-EPST, ARC INRIA, and ACI IMPBio ENS, Paris ; INRIA ; UJF, Grenoble ; UHA, Mulhouse

Draft of stress response network CRP Stable RNAs Supercoiling Activation Stress signal Fis fis P rrn P1 P2 nlpD1 nlpD2 σS rpoS RssB rssB ClpXP crp topA Px1 cya P1/P1’ P3 gyrAB gyrI Cya GyrAB GyrI TopA Laget et al. (2004)

Validation of network models Bottleneck of qualitative simulation: visual inspection of large state transition graphs Goal: develop a method that can test if state transition graph satisfies certain properties Is transition graph consistent with observed behavior? Model checking is automated technique for verifying that finite state system satisfies certain properties Computer tools are available to perform automated, efficient and reliable model checking (NuSMV) Clarke et al. (1999), Model Checking, MIT Press

Model checking Use of model-checking techniques transition graph transformed into Kripke structure properties expressed in temporal logic . xa<0 xb=0 xb>0 xa>0 xb<0 xa=0 There Exists a Future state where xa>0 and xb>0 and starting from that state, there Exists a Future state where xa=0 and xb<0 . QS1 QS3 QS4 QS5 QS7 QS8 QS6 QS2 EF(xa>0 Λ xb>0 Λ EF(xa=0 Λ xb<0)) . Yes!

Summary of approach Test validity of B. subtilis sporulation models . EF(xhpr>0 Λ EF EG(xhpr=0)) . model checking Kripke structure temporal logic - Signal “ [The expression of the gene hpr] increase in proportion of the growth curve, reached a maximum level at the early stationary phase [(T1)] and remained at the same level during the stationary phase” (Perego and Hoch, 1988) Batt et al. (2004), SPIN-04, LNCS

Conclusions Implemented method for qualitative simulation of large and complex genetic regulatory networks Method based on work in mathematical biology and qualitative reasoning Method validated by analysis of regulatory network underlying initiation of sporulation in B. subtilis Simulation results consistent with observations Method currently applied to analysis of regulatory network controlling stress adaptation in E. coli Simulation yields predictions that can be tested in the laboratory

Work in progress Validation of models of regulatory networks using gene expression data Model-checking techniques Search of attractors in phase space and determination of their stability Further development of computer tool GNA Connection with biological knowledge bases, … Study of bacterial regulatory networks Sporulation in B. subtilis, phage Mu infection of E. coli, signal transduction in Synechocystis, stress adaptation in E. coli

References de Jong, H. (2002), Modeling and simulation of genetic regulatory systems: A literature review, J. Comp. Biol., 9(1):69-105. de Jong, H., J. Geiselmann & D. Thieffry (2003), Qualitative modelling and simulation of developmental regulatory networks, On Growth, Form, and Computers, Academic Press,109-134. Gouzé, J.-L. & T. Sari (2002), A class of piecewise-linear differential equations arising in biological models, Dyn. Syst., 17(4):299-316. de Jong, H., J.-L. Gouzé, C. Hernandez, M. Page, T. Sari & J. Geiselmann (2004), Qualitative simulation of genetic regulatory networks using piecewise-linear models, Bull. Math. Biol., 66(2):301-340. de Jong, H., J. Geiselmann, C. Hernandez & M. Page (2003), Genetic Network Analyzer: Qualitative simulation of genetic regulatory networks, Bioinformatics,19(3):336-344. de Jong, H., J. Geiselmann, G. Batt, C. Hernandez & M. Page (2004), Qualitative simulation of the initiation of sporulation in B. subtilis, Bull. Math. Biol., 66(2):261-340. GNA web site: http://www-helix.inrialpes.fr/article122.html