HEMIPLEGIE ALTERNANTE INSERM – Université Pierre et Marie Curie GENETIQUE ET HEMIPLEGIE ALTERNANTE Dr Sophie NICOLE INSERM – Université Pierre et Marie Curie Pitié-Salpêtrière « Génétique et mécanismes des maladies de l’excitabilité musculaire et de la sclérose en plaques»

Génétique et hémiplégie alternante? Très probablement car : signes cliniques stéréotypés pas de lien avec un facteur particulier (grossesse, environnement,…) cas familiaux (jumeaux monozygotes) hémiplégie alternante liée à une mutation ATP1A2, SLC1A3 et CACNA1A

Corps, organes, cellules et chromosomes Un corps humain est composé d’organes Chaque organe est composé de cellules (1 péta (1015 ) cellules dans le corps humain) 23 paires de chromosome Une cellule contient 23 paires de chromosomes

Chromosomes, gènes et bases : ADN Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide DéoxyriboNucléique) L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de bases Les chromosomes contiennent des gènes L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes

Chromosomes, gènes et bases : ADN Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide DéoxyriboNucléique) L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de bases Les chromosomes contiennent des gènes L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes BASE GENE CHROMOSOME lettre phrase livre

Gènes et protéines Un gène code pour une protéine La protéine exerce une fonction cellulaire Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirs chromosome gène la maitresse nous donne beaucoup trop de devoirs exons LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAUCOUP TROP DE DEVOIRS protéine Fonction cellulaire

Gènes, protéines et cellules

Protéines et maladies Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une maladie L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation dans le gène Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirs chromosome Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirs chromosome muté Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirs gène la maitresse nous donne beau de devoirs exons LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAU DE DEVOIRS protéine

trouver l’anomalie parmi 3,2 milliards de lettres Protéines et maladies Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une maladie L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation dans le gène trouver l’anomalie parmi 3,2 milliards de lettres

Comment identifier l’anomalie génétique? Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage) - l’association française contre les myopathies : 20.000 euros - l’AFHA : 30.000 euros débutée en juin 2008. Au 30 octobre : - 22 familles - 72 personnes données cliniques essentielles - médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE

Comment identifier l’anomalie génétique? Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage) - l’association française contre les myopathies : 20.000 euros - l’AFHA : 30.000 euros débutée en juin 2008. Au 30 octobre : - 22 familles - 72 personnes données cliniques essentielles - médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE - base de données européenne ENRAH conseil scientifique en cours d’établissement - banque (1) - AFHA (1) - neuropédiatre et chercheur (2-3) Ouverte à tout projet de génétique sur l’HA

Comment identifier l’anomalie génétique? Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche Mode de transmission : dominant de novo possible dominant dominant de novo Etudes moléculaires de l’ADN des patients comparés à des individus « témoins »

Etudes moléculaires de l’ADN Approche gènes candidats: Idée sur la fonction cellulaire altérée - faite par les équipes américaines, hollandaises et italiennes Migraine hémiplégique familiale - gènes ATP1A2, CACNA1A Pas de mutation dans les cas d’ hémiplégie alternante « typique » Nombre gènes candidats trop important pour poursuivre cette approche

Etudes moléculaires de l’ADN II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans la totalité du génome oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») 1 patient aux USA: rien de trouvé 1 patient allemand, qui devrait être étudié (Pays-Bas)

Etudes moléculaires de l’ADN II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome entier oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) Plateforme Illumina « P3S »

Etudes moléculaires de l’ADN II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome entier oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) sonde ADN à tester

Etudes moléculaires de l’ADN II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome entier oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) ADN contrôle (parents) ADN enfant

Etudes moléculaires de l’ADN II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome entier avantages : - manipulation rapide - pas d’a priori biologique désavantages : - chère car nouvelle technologie support informatique faites aux Etats-Unis (K. Svoboda)?

Projet de recherche Recherche d’anomalies submicroscopiques par SNP-CGH arrays (Illumina) Janvier - septembre 2009 Analyse de 100 patients européens (idéal) - 400 euros par patient : 40.000 euros analyses informatiques réalisée par Chirine El Baba (étudiante M2 : BAC + 5 ans) Septembre 2009 - juin 2010 Validation des remaniements candidats - SNP-CGH arrays chez les parents si plus de 20 remaniements / patient 16.000 euros (estimation 20 patients) - quantitative real-time PCR 20.000 euros (estimation 50 remaniements) - rémunération d’un doctorant (3 ans) coût patronale de 2.400 euros/mois soit 28.000 euros / an - Total coût 20.000 à 64.000 euros

Futur… Remaniements pathologiques candidats : - études des gènes de la région - recherche de mutation chez les patients sans remaniements Pas de remaniements pathologiques candidats : recherche de modifications épigénétiques envisagée en Belgique? séquençage génome complet de plus en plus envisageable…

Prof Bertrand Fontaine Chirine El Baba Prof Bertrand Fontaine

Immunomarquage PLN sur fibroblastes humains   Culture de fibroblastes - ensemencement 1.5.104 à 2.104 cellules par puit (100 µl maximum/puit) 2 boites et 2 puits/boite par individu (3 puits pour le témoin) - après ½ journée, rajouter 1 ml de milieu/boite (milieu + 10% SVF) - laisser pousser de 4 (2.104 ) à 6 (1.5.104) jours (jusqu’à ce que cellules soient confluentes) Immunomarquage - rinçage PBS 1X - fixation PFA4% froid, 10 min à 4°C - rinçage 3X PBS1X - rapide rinçage PBS-tween 0.1% - incubation anticorps primaire. 1H00, T° ambiante 1 série avec triton : PBS-BSA3% + triton-X100 0.1% 1 série sans triton : PBS-BSA3% - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab.) + anti-fibronectine (1/500 ; F3648, Sigma-Aldrich) - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab) + anti-DV (1/100; R. Timpl, lapin). - 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante - incubation anticorps secondaire. 1H00, T° ambiante (PBS-BSA3%) - anti-souris FITC (1/100 ; whole IgG, Jackson immunoresearch) + anti-lapin-TR (1/100, Jackson Lab) - 5 min Hoechst 1/100 dans PBS1X - rinçage 1X PBS1X rapide rinçage H2O et montage fluoromount-G (Southern Biotechnology). ! pas de montage en vectashield car cellules se décollent.

Coût estimé Euros HT Echantillon 20 familles (60 ech.) Illumina (P3S) 304 20.000 lames CNV610-Quad 300 échantillon 2 run 1,5 Affymetrix (Strasbourg) 595 35.700 sonde 345 lames SNP 6.0 250 Agilent (Strasbourg) 823 49.380 sonde 345 lames 1 X 244K 478 (X 2?)