L’isolement et la manipulation des gènes B. Quelques applications de l'ADN recombinant La synthèse des gènes et leur expression : la production de protéines recombinantes. Organismes transgéniques: plantes. Thérapie génique. Détection des gènes responsable des maladies génétiques. Objectifs Connaître quelques applications de l'ADN recombinant.

Expression de l’hormone de croissance humaine, avec élimination de la séquence humaine de signalisation

Production pharmaceutique de l’insuline humaine

Système d'expression en 2 étapes: Amplification

Génétique inverse La génétique inverse se base sur la construction de mutants pour découvrir le phénotype d'un gène (génotype). Génétique Génétique inverse phénotype mutant séquence d'une protéine allèle mutant séquence d'ADN séquence d'ADN allèle mutant séquence de la protéine phénotype mutant?

Organismes transgéniques Modification du génome d'une espèce par l'introduction d'ADN extrinsèque De la même espèce ou d'une espèce différente Méthodes d'introduction 1- transformation 2- injection 3- virus 4- bombardement

Destruction d'un gène Intégration homologue (même locus) ou hétérologue (locus différent)

2) Enlever des gènes Problème: Les tomates mûres sont trop fragiles pour être transportées Solution habituelle 1) Cueillies vertes et transportées dans des camions réfrigérés 2) Exposées au gaz éthylique avant d'être envoyé aux magasins A) Stimule la synthèse de carotène (couleur) B) Stimule la synthèse de sucres (goût) C) Stimule la dégradation de la pectine dans les parois des cellules (amollissement)

Pas de traduction de l’enzyme PG Solution génétique : Production de tomates qui restent fermes lorsqu'elles mûrissent En inhibant la production de l'enzyme polygalacturonase (PG) qui catalyse la solubilisation de la pectine En produisant de l'ARNm antisense: qui sera complémentaire à l’ARNm du gène de l’enzyme PG. Ceci entraîne une inhibition de la traduction. Nature 334: 724-726 (1988) Plant Mol. Biol. 14: 369-379 ARNm Pas de traduction de l’enzyme PG Anti-ARNm

Critiqué, parce que: 1) La construction anti-PG est réalisé dans un plasmide qui contient un gène de résistance à un antibiotique. La résistance à cet antibiotique pourrait être transmise à des bactéries vivant dans le sol. Ce gène était nécessaire pour la sélection de cellules ayant la construction anti-PG. 2) L'insertion de ces gènes dans le chromosome des tomates pourrait aussi causer une mutation par intégration dans le génome.

Trois types de thérapie génique

Thérapie somatique Les virus seront les vecteurs portant un allèle sain du géne deficient dans une maladie donnée A) Rétrovirus désarmé : Intégration aléatoire (possibilité de muter un gène utile). N'affectent que les cellules en cours de prolifération (sanguines). Utilisé dans la SCID (enfants-Bulles) B) Adénovirus Ne s'intègre pas dans le génome (pas d'inactivation par insertion) Infecte aussi les cellules en état de non-prolifération Limité aux cellules épithéliales du système respiratoire Mucoviscidose: gène CFTR

Détection des gènes responsables des maladies génétiques: Diagnostic

Techniques classiques de détection 1) Détection de modifications physiologiques Ex. Phénylcétonurie => accumulation de phénylalanine 2) Détection de présence ou absence d'activités enzymatiques Ex. Galactosémie => pas de galactose 1-puridyl transférase Problème: ne permet pas de détecter les maladies qui ne s'accompagnent pas de ces modifications Ex. Ne permet pas de détecter la dystrophie de Duchenne Solution: cloner le gène et établir quels allèles sont présents 1) sites de restriction dans la séquence codante 2) sites de restriction près de la séquence codante 3) sonder avec des oligonucléotides 4) séquençage

Sites de restriction dans la séquence codante Gène fonctionnel = A = 999 bases = 333 acides aminés Gène non-fonctionnel = a = 996 bases = 332 acides aminés lys glu gly phé fonctionnel = ... AAA GAA GGC TTC ... non-fonc. = ... AAA GAA --- TTC ... base 661 Eco RI

Après une digestion avec Eco RI: 1) homozygote pour le gène fonctionnel (AA) Un fragment d'ADN de 999 bases 2) homozygote pour le gène non-fonctionnel (aa) Un fragment d'ADN de 666 bases et Un fragment d'ADN de 330 bases et 3) hétérozygote (Aa) Un fragment d'ADN de 999 bases et Un fragment d'ADN de 330 bases 1 2 3

Anémie falciforme Maladie : Disparition d’un site de restriction dans la séquence codante du gène de beta-globine. AS 1.3 1.1 0.2