CHERCHEUR DE METAPHASES APPLIED SPECTRAL IMAGING Colloque ATC-20/21 Septembre 2010 Chevallier Suzanne Gegas Laëtitia Hôpital Necker-Enfants Malades Histologie, Embryologie et Cytogénétique Pr Vekemans

CHERCHEUR DE METAPHASES APPLIED SPECTRAL IMAGING Colloque ATC-20/21 Septembre 2010 Chevallier Suzanne Gegas Laëtitia Hôpital Necker-Enfants Malades Histologie, Embryologie et Cytogénétique Pr Vekemans

CHERCHEUR DE METAPHASES APPLIED SPECTRAL IMAGING Colloque ATC-20/21 Septembre 2010 Chevallier Suzanne Gegas Laëtitia Hôpital Necker-Enfants Malades Histologie, Embryologie et Cytogénétique Pr Vekemans

CHERCHEUR DE METAPHASES APPLIED SPECTRAL IMAGING Colloque ATC-20/21 Septembre 2010 Chevallier Suzanne Gegas Laëtitia Hôpital Necker-Enfants Malades Histologie, Embryologie et Cytogénétique Pr Vekemans

CHERCHEUR DE METAPHASES APPLIED SPECTRAL IMAGING Colloque ATC-20/21 Septembre 2010 Chevallier Suzanne Gegas Laëtitia Hôpital Necker-Enfants Malades Histologie, Embryologie et Cytogénétique Pr Vekemans

Avant l’arrivée du Chercheur (2008) Au commencement, il y avait… Avant l’arrivée du Chercheur (2008) Post-natal 1200 caryotypes sang, fibroblastes. Onco-hématologique 1200 caryotypes sang, moelle, ponctions. Au commencement, il y avait 4 secteurs bien distincts avec chacun une organisation, une activité, une équipe technique et médicale, et des types de prélèvements spécifiques. MOI : technicienne en cytogénétique post-natale. Autres secteurs à présenter. Moléculaire 2000 FISH préparations cytogénétiques, apposition de tissus, cryocoupes, coupes paraffinées. Pré-natal 800 caryotypes liquide amniotique, villosités choriales, sang fœtal.

2 techniciens détachés à l’informatique et la gestion du matériel.                                      2 techniciens détachés à l’informatique et la gestion du matériel.

Comment dégager du temps pour suivre l’évolution de la discipline ? Développer la CGH-array. Réduire l’étape chronophage de recherche des métaphases qui occupe 60% du temps technique. Acquérir un Chercheur !

Cahier des charges publié en 2008 Peut traiter tous les types de préparations du laboratoire, Travaille aussi bien en lumière transmise qu’en épi-fluorescence, Permet la recherche de métaphases et d’interphases, S’adapte au mieux à l’organisation existante, Fonctionne via le réseau de l’hôpital. Solution globale... On a sans doute été un peu trop exigeants!

Présentation du chercheur 1 poste de travail informatique avec une grande capacité de stockage temporaire et un puissant processeur, 1 microscope Olympus lumière transmise et épi-fluorescence, 1 caméra haute définition, 1 distributeur d’huile automatique, 1 lecteur codes à barres, 1 platine motorisée, 1 chargeur, 1 serveur pour l’archivage des données.

9 plateaux de 9 lames!

Applications en cytogénétique post-natale : mode « tout automatique ».

Stations de traitements Chercheur de Métaphases Configuration de l’installation Serveur de fichiers Stations de traitements Archivage (1 image tiff=1 megaocte) (800 Go/ an) RESEAU institutionnel (APHP) RESEAU du labo. Etiquettes code à barres S.G.L (système de gestion de labo.) Transmission des données patients Chercheur de Métaphases

Dès l’enregistrement des prélèvements, les données du patient sont importées automatiquement dans la base du logiciel de gestion grâce à une interface entre celui-ci et notre logiciel de gestion des prélèvements. Le dossier et les lames nécessaires ( 2 lames en Bandes R + 2 lames en Bandes G + 1 lame en Giemsa + 2 lames en FISH) sont immédiatement créées et les étiquettes code à barres peuvent être imprimées.

Installation des lames sur le plateau.

Mise en place du plateau dans le chargeur.

Mise en route de SCANVIEW, le logiciel de Scan.

START…le technicien peut rentrer chez lui ! Chercheur travaille de nuit!

Chargement du plateau sur la platine et lecture des codes à barres de chaque lame. Le code à barres permet l’identification du patient et l’association entre la lame et le type de paramètres de lecture à appliquer.

Les lames sont scannées à l’objectif 10 par balayages gauche-droite sur la surface définie. Le temps de scan dépend du nombre d’éléments présents sur la lame :  environ 4 minutes pour 1000 éléments.

L’huile est distribuée et étalée automatiquement.

Les 30 premières métaphases classées par « qualité » sont relocalisées à l’objectif 100 de façon automatique :  environ 15 secondes par métaphase. Dés la relocalisation terminée, le plateau est replacé dans le chargeur. Les métaphases capturées sont accessibles sur le logiciel de traitement (Bandview).

Applications en cytogénétique moléculaire. Laetitia vous a parlé de l’application en post-natal moi je vais poursuivre avec la CM.

Pour ce qui est de FISH métaphasique : L’appareil screen la plage d’HIS au filtre DAPI à l’objectif 10 à la recherche de méthaphases Puis il relocalise les méthaphases trouvé à l’objectif 100 et ce avec la séquence de filtre qu’on lui préalablement paramétré. Recherche de métaphases au DAPI à l’objectif 10. Relocalisation des métaphases à l’objectif 100 avec la séquence de filtres paramétrée.

Pour la FISH interphasique il existe une application spécifique. L’appareil sreen la plage d’HIS à l’objectifs 63 et capture simultanément les objets correspondant aux critères d’un noyau et ce avec la séquence de filtre paramétrè et suivant le nb de plan prédéfinis Ex: le diamètre d’un noyau de lymphocyte est de 7 µm donc on lui a demandé de faire 7 images/noyau à raison d’une image tout les µm. les 7 différent plan sont ensuite confondu en 1 seul donnant une vignette de très grande qualité. La durée de ces scans est variable…. Recherche des objets à l’objectif 63 et capture simultanée des objets correspondant aux critères morphologiques d’un noyau avec la séquence de filtres et suivant le nombre de plans paramétrés.  Durée très variable et fonction de la densité cellulaire (20 à 40 min/plage d’HIS)

Résultats après relecture : Résultats bruts : Résultats après relecture : Parallelement à cette prise de vignette le logiciel propose une analyse du nombre de siganux détecté et présente les donnée sous forme graphique. Ex: dans cette population cellulaire il a 47% de cellules normales 2v2r et 2b Analyse automatique du nombre de signaux. Présentation des résultats sous forme graphique. Nécessité d’une relecture.

L’automatisation de la FISH en pratique  Temps de rendu d’un dossier FISH automatisé 1h10. Scan métaphasique (10 min) + scan interphasique (40 min) + analyse des données (20 min) = 1h10 ! Acceptable uniquement pour les dossiers non urgent (scan pendant la nuit).  20 % des dossiers nécessitent une relecture manuelle. (scan inexploitable : pb. de foccus, de surexposition) L’automatisation est inadaptée quand on doit répondre dans l’urgence ou à un nombre restreint d’échantillons ! ON NE PEUT NOMMER QU’A POSTERIORI et très vite se mélanger si un patient a plusieurs hybridations point d’initialisation unique probabilité d’une initialisation incorrecte (fucus, intensité de la fluorescence) à fort grossissement (objectif 63 ou 100) est assez élevée.

1 an après l’installation (2010). Bilan global mise en place douloureuse pour chacun d’entre nous par ce qu’est difficile de passer brutalement d’un niveau 0 d’automatisation à un niveau si éléve, difficile aussi de faire le deuil d’une conception artisanal de notre travail (perte de contrôle sur nos résultats) Quoi qu’il en soit nous sommes toujours… Cet automate nous a permis d’affronter la rigueur budgétaire en vigueur dans la fonction publique (cette année on a perdu 2 postes de technicien), Et une fois dépassée le stress de l’installation et du paramétrage il améliore grandement l’ergonomie du travail en diminuant considérablement le temps passé au microscope. Il facilite aussi la validation médical car toutes les vignettes sont disponible sur écran il n’y plus besoin, en théorie, de revoir les lames au microscope. L’acquisition de cet appareil a aussi été l’occasion d’améliorer la tracabilité du rendu de résultat( code barre) on ne serais certainement pas allé aussi loin dans cette démarche sans cet achat. Nous sommes maintenant un laboratoire toujours sectorisé mais réuni autour du Chercheur. Cet automate nous a permis de passer la rigueur budgétaire en vigueur à l’AP-HP, ont a perdu 2 postes à activité constante ! Mise en place difficile, Amélioration de l’ergonomie et facilitation de la validation médicale, Cet automate nous a permis d’affronter la rigueur budgétaire.

Bilan secteur par secteur Au bout du compte, il y a… Bilan secteur par secteur Post-natal  fonctionnement en « tout automatique »,  maintien de l’activité malgré la perte d’un poste de technicien. Onco-hématologique  fonctionnement en « semi-automatique »,  augmentation de l’activité à moyen humain constant. Chercheur en mode semi-automatique uniquement Car nous sommes dans le cas de pathologies clonales, avec des métaphases de qualité hétérogène, pour ne pas passer à côté de clones pathologiques il est indispensable que cette hétérogénéité se reflète dans les vignettes choisies ceci n’est pas automatisable ! On ne peut bien sure pas concevoir des paramètres de capture permettant la sélection d’objets si différents ( les métaphases jolies et moches) en une étape, les paramètres de capture utilisés sont donc suffisamment larges pour détecter tous types d’objets et le choix est laissé à l’appréciation du technicien. Pré-natal  n’utilise pas le chercheur : paramètres de capture à améliorer, pas de fusion possible sur les métaphases « éclatées ». Moléculaire  pas de gain de temps,  aucune urgence,   qualité du rendu de résultat .

Pour une automatisation sans « douleur » Apprendre une méthode de relaxation collective ! Bien s’entourer : Détacher un référent, choisir un fabricant ayant un SAV disponible, proche géographiquement et parlant français. Anticiper l’automatisation : Standardisation et homogénéisation des techniques entre les différents secteurs (plage et densité d’étalement, numérotation des dossiers), mise en place d’étiquettes code à barres. Tester en condition réelle : fonctionnement via le réseau informatique, compatibilité avec les antivirus et systèmes d’exploitations institutionnels. Apres ce bilan qq petits conseil pour une automatisation sans douleurs «  apprendre une méthode de relaxation c » C’est une boutade mais c’est pour mettre l’accent sur le fait que tout chagemment aussi profond d’organisation de méthode de travail est forcement nottament quand pendant l’installation on continue toujours a assurer le rendu de résultat. Quand il faut consillier le temps de mise en place et les temps de rendu de résultat. n est toujours un peu anxiogéne Pour limiter ce stress Il nous parrait primordial de bien s’entourer … Anticiper Tester en condition réel Malgré toute cette bonne préparation l’automatisation restera toujours un moment délicat car nous exerçons une discipline confidentiel et les appareils qui nous sont proposé ne sont pas aussi robustes que les automates de biochimie, ce sont des automate très sophistiqué des sortes de formule 1 mais voilà une forme 1 c’est moins robuste qu’une voiture de série. Cette automate travail correctement qu’on lui demande d’appliquer un nombre restreint de paramètres de pilotage sur de grand échantillon mais montre ces limite quand elle doit appliquer des paramètres de pilotage très divers sur de moyenne voir de petite série et ce qui est notre cas dans les laboratoire hospitalier. Notre pouvoir d’achat est aussi assez modeste par conséquent donc notre pouvoir de pression sur le constructeur pour qu’il fasse évoluer sa machine pour répondre à nos besoin est aussi assez limité. La machine doit s’adapter à notre façon de travailler mais pour toutes ces raison c’est aussi à nous de nous adapter à elle. L’accouchement sans douleur est en fait une méthode de relaxation et de respiration qui permet de canaliser et de contrôler la douleur. Méthode pionnière avant l’arrivée de l’analgésie péridurale, elle est enseignée pendant les cours de préparation à l’accouchement. La péridurale Utilisation confidentielle = pouvoir de Notre pouvoir de pression sur le fabriquant pour qu’il fasse évoluer la machine pour répondre nos besoins spécifiques est limité…Il faut donc accepter de s’adapter au fonctionnement de la machine. Un Automate est une machine très sophistiquée mais fabriquée pour une discipline « confidentielle » : une formule 1 est forcement moins robuste qu’une voiture de série. Faiblesse de cet automate sophistiqué : grandes variétés de paramètres sur de moyennes voir petites séries. Utilisation confidentielle = pouvoir de pression sur le fabriquant limité. Il faut donc accepter de s’adapter au fonctionnement de la machine.

Bon courage à tous ceux qui se lancent dans un projet d’automatisation. Cela dit on voudrait souhaiter bon courrage à tous

Le chercheur est plus efficace qu’un technicien Et nous ne resistons pas à l’envie de parodier les devises shadok Sauf si on supprime le technicien.

Un paramétrage très accessible… La création des profils de pilotage et d’acquisition du chercheur se fait par emboitement de paramètres gigognes définissant les différentes actions à exécuter. Template (anglais) =gabarit , patron Le template (gabarit) l’ensemble des paramètres à appliquer sur une lame donnée. Application = type de logiciel à utiliser recherche de méthaphase ou spotcounting par exemple Process= objectif à utiliser, nb de plan d’acquisition 1 seul plan, z-staking, 3D etc Classifieur = critère de détection d’un objet Région = région à scanner sur la lame Probe= séquence de filtre, taille des signaux Template Application Process Classifieur Région Probe

En modifiant les sous-paramètres ont peut créer des profils à l’infini. Et s’adapter ainsi facilement aux différents prélèvements et techniques du laboratoire.