Cours Spectrométrie de Masse Introduction Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique Dir : Alain Van Dorsselaer UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg Tel: 03 68 85 26 79 sarah.cianferani@unistra.fr Cours ESBS Oct 2010
Plan Mardi 12/10 : Théorie de la MS : Les Bases de la Spectrométrie de Masse - Introduction à la spectrométrie de masse - L’ionisation MALDI - L’ionisation Electrospray - La Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Mercredi 13/10 : Utilisation de la MS en biologie - Utilisation de la spectrométrie de masse en analyse protéomique - La spectrométrie de masse des complexes non covalents
Spectrométrie de masse : introduction générale Définitions 1- Présentation d’un spectre de masse 2- Unité de mesure: le Dalton 3- Masse moléculaire monoisotopique 4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique) L’instrument : structure d’un appareil de spectrométrie de masse 1-Structure d’un instrument : source et analyseur 2- Rôle des champs l’électrostatiques 3- Rôle et systèmes de génération du vide 4- Présentation des principales sources EI, FAB, MALDI, ESI 5- Présentation des principaux analyseurs Magnétique, quadrupôlaire, trappe d’ion, TOF, FT-ICR 6- La MS-MS
Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ? C’est une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées (spectrométrie de masse moléculaire) ou de complexes non covalents ionisés (spectrométrie de masse supramoléculaire)
Historique 1912 : spectres de masse de O2, N2, CO, CO2, COCl2 (JJ. Thomson) 1930 : Application de la MS à la chimie organique (R. Conrad) 1948 : Principe de l’analyseur à temps de vol (TOF) (AE. Cameron) 1951 : Application de la résonnance cyclotron à la MS (H. Sommer) 1953 : Brevet pour l’analyseur à quadripôle et l’ion trap (W. Paul) 1958 : 1ers spectromètres de masse couplés à la GC (en 1975 : appareils GC-MS de routine) 1966 : Ionisation chimique (MSB. Munson et FH. Field) 1967 : introduction de l’informatique !!!!!!!!!!!! 1981 : Ionisation par FAB (M. Barber) 1er spectre complet de l’insuline 5807 Da 1985 : Ionisation MALDI (F. Hillenkamp) 1989 : Ionisation Electrospray ESI (J. Fenn)
m/z Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ? 1- La masse moléculaire d’un composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité m/z Pic Moléculaire Fragments Nombre d’ions
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ? 1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire 2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative 6 8 1 2 4 3 D a / e % 7 . 9 5 Cholestane Pic moléculaire Fragments Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.
Pic moléculaire et masse moléculaire : définition La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la molécule étudiée, sans qu’il y ait eu rupture d’une liaison. La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d’une charge électrique. La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire (formule brute) de l’ion moléculaire. L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires. On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire ») La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic moléculaire ».
Pour cette molécule de 10 atomes de carbone, un atome de C13 peut être dans 10 positions différentes,mais la masse de la molécule est toujours la même. Masse M C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 Masse C13- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 Masse M+1
Quelle masse mesure-t-on ? Masse monoisotopique c’est la masse du premier pic du profil isotopique c’est-à-dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, …). Masse chimique ou moyenne c’est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique c’est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).
Quelle masse mesure-t-on ? Masse moyenne Pic monoisotopique P P+1 P+2 P+3 m/z m/z Masse monoisotopique: dans le massif isotopique, on l’appelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appelés les pics P+1, P+2, P+3,…. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds d’un éléments.
R = M/DM De quoi dépend la nature de la masse mesurée ? DM Vallée à 10 % M M + DM La résolution mesure l’aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de l’ion M+DM
Quelle masse mesure-t-on ? Masse moyenne Pic monoisotopique P P+1 P+2 P+3 m/z m/z
Massif isotopique et résolution M = 246 Da M = 502 Da
Massif isotopique et résolution M = 1059 Da M = 2101 Da
Massif isotopique et résolution M = 4957 Da M = 20417 Da
Pour un peptide de 18 acides aminés, le pic monoisotopique n’est déjà plus le pic majeur
Quelle sont les unités de mesure ? La masse m s’exprime en Dalton (Da) 1 Da = 1/12 .12 . 10-3 kgmole-1 / N (N = 6, 022045 . 1023) Et donc: 1 Da = 1,66 . 10-27 kg C12 = 12,000000000 C13 = 13,003354839 H1 = 1,0078250 H2 = 2,0141018 O16 = 15,9949146 S32 = 31,9720718 N14 = 14,0030740 Cl35 = 34,968852729 Cl37 = 36,965902624
La sensibilité : combien de molécules peut-on détecter et mesurer ? 1 mole 6.1023 molécules 1 millimole 6.1020 molécules 1 micromole 6.1017 molécules 1 nanomole 6.1014 molécules 1 picomole 6.1011 molécules 1 femtomole 6.108 molécules 1 attomole 6.105 molécules 1 zeptomole 6.102 molécules Quantités utilisées habituellement en SM
Un spectrométre de masse mesure la masse de molécules isolées Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes: 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres: on passe de l’état de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/nb de charges (z)
Principes de la MS Production d’ions en phase gazeuse Les ions sont ensuite séparés en fonction de leur masse ou plus précisément du rapport masse-sur-nombre de charges m/z Les ions sont ensuite détectés en proportion de leur nombre Système d’introduction de la substance à analyser (chromatographie en phase gazeuse, liquide, électrophorèse, etc.) Source Analyseur(s) Détecteur Ionise la substance à analyser Sépare les ions produits en fonction de leur rapport m/z Compte le nombre d’ions Système de traitement des données
Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties : 1- La source d’ion : pour volatiliser et ioniser Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de source d’ions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu. 2- L’analyseur: pour mesurer m/z Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z) C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur. CECI IMPLIQUE: Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ions dans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique) Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans être détruits ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcours moyen)
Les unités de mesures des pressions sont nombreuses. L’unité officielle est le pascal (Pa): 1 pascal = 1 N/m2 On utilise également: L’atmosphère 1 atm = 101 325 Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar Le bar 1 bar = 105 Pa (=106 dyne/cm2) Le millibar 1 millibar = 10-3 bar = 102 Pa Le Torr 1 Torr = 1mm Hg Le Psi 1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar. Les valeurs du vide dans l’analyseur sont en général: 10-5 mbar : pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire) 10-6 mbar : pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long). 10-7 mbar : pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long). 10-7 mbar : pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long). 10-9 mbar : pour un analyseur ICR (orbite circulaire).
La source d’ions : son rôle est de volatiliser et d’ioniser Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et d’ioniser un type de composé est choisi par l’opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon le type de source. Les critères de choix principaux sont: la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser sa labilité chimique les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation la taille des molécules les quantités de produit disponibles le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)
Les sources d’ions se classent en sources « dures » et en sources « douces » De très nombreuses méthodes d’ionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliser des molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires. Les « ionisations dures » génèrent souvent des ions moléculaires qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant d’avoir eu le temps de sortir de la source. Leurs fragments peuvent être analysés et donnent des informations de structures. Les « ionisations douces » génèrent des ions moléculaires qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser l’analyseur, arriver jusqu’au détecteur, et donc être mesurés.
Quelles informations peut apporter une source à ionisation dure ? 1- La masse moléculaire d’un composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité Pic Moléculaire Nombre d’ions Fragments M/z
Quelles informations peut apporter un soure à ionisation douce ? 1- La masse moléculaire d’un composé 2- Pas de fragmentation 3- Une mesure de la quantité Pic Moléculaire Nombre d’ions M/z
Les Sources d’Ionisation les plus utilisées Ionisation à Impact électronique (IE) Ionisation Chimique (IC) Ionisation par bombardement d’ions ou d’atomes rapides (LSIMS ou FAB) Petites molécules volatiles et thermostables DURES molécules < 6000 Da ASSEZ DOUCES Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI) Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI) Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique DOUCES
From the official Nobel press release : Prix Nobel de chimie 2002 From the official Nobel press release : « Mass spectrometry is a very important analytical method used in practically all chemistry laboratories the world over. Previously only fairly small molecules could be identified, but John B. FENN and Koichi TANAKA have developed methods that make it possible to analyse biological macromolecules as well ».
L’analyseur : pour mesurer m/z Il existe différents types d’analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. C’est une partie de l’appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans l’appareil pour atteindre le détecteur. B: Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien) Q: Déflexion par un champ quadrupolaire IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap) TOF: Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR: Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l’analyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur dépend de l’intensité du champ d’extraction On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MSn) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents.
Les caractéristiques principales d'un analyseur sont : La résolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ions le traversent Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines limites. Chaque type d'analyseur a son "point fort".
R = M/M Résolution d’un analyseur Pour un pic : Résolution R détermine la finesse des pics et donc la capacité à distinguer des pics proches. Plus la résolution est élevée, plus le pic sera fin et plus il sera possible de distinguer des pics proches. R = M/M Vallée à 50 % = Largeur à mi-hauteur M Vallée à 10 % Vallée à 10 % Entre deux pics : la Résolution R est la capacité à séparer deux pics distants d’une différence de masse M ie aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de l’ion M+M
Caractéristiques des analyseurs Analyseurs Résolution Gamme m/z Quadripôle (Q) 2 000 8 000 Magnétique (EB) 20 000 20 000 Temps de vol (TOF) 20 000-60000 500 000 Trappe ionique 5 000-20000 6 000 Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR) 1 000 000 4 000
L’analyseur à temps de vol Analyseur : TOF Source : MALDI Ultraflex
Principe de l’analyseur TOF Les ions sont expulsés de la source par paquets 2 régions principales : une région d’accélération des ions une région libre de champ E 25 kVolts 0 volts Départ Formation des ions par un bref tir laser (5 nano sec.) Détection Mesure du temps écoulé depuis le départ des ions Zone de vol libre d’accélération Zone d’accélération Cible
Principe de l’analyseur TOF Les ions sont formés ou échantillonnés en paquets et sont ensuite accélérés pour acquérir une énergie cinétique fixe. A un ion de masse m et de charge z, une tension U est appliquée dans une zone dite zone d’accélération. L’ion acquiert une énergie cinétique Ec correspondant à une vitesse v : Dans un tube de vol de longueur L, le temps de vol t (time of flight) ou durée du parcours est lié à la vitesse v et le temps de vol est égal a :
Analyseur TOF Exemple : Longueur du tube de vol L = 1 m U = 3000 V z = 1 m1 = 1000 uma m2 = 1001 uma m3 = 2000 uma m4 = 2001 uma On a donc un temps de vol : t1 = 41,5905 msec t2 = 41,6113 msec t3 = 58,8178 msec t4 = 58,8325 msec t = 0.0208 sec = 20.8 nanosec t = 0.0147 sec = 14.7 nanosec
Sensibilité très élevée des TOFs L’analyseur TOF : Résumé C’es un analyseur pulsé : les ions sont envoyés par paquets (≠ quadripôle à balayage continu) Sensibilité très élevée des TOFs Dans la pratique : gamme de masse illimitée (la limitation technique vient du détecteur) et résolution maximale jusqu’à 60000 (en général 20000). En général, résolution mono-isotopique TOF = analyseur haute résolution Grande transmission : 90% des ions arrivent au détecteur (≠ quadripôle à balayage continu)
- L’analyseur quadripolaire + Formé de quatre barres de métal parallèles (section hyperbolique) entre lesquelles les ions sont injectés avec une énergie cinétique de quelques électron volts. - + Un ion + sera attiré vers une barre -. Si le potentiel de la barre change de signe avant que l’ion ne soit déchargé sur la barre, alors l’ion change de direction. C’est un analyseur basé sur la « stabilité de la trajectoire » des ions entre les barres
L’analyseur quadripolaire
L’analyseur quadripolaire: Résumé Le quadripôle fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire inconvénient : beaucoup de perte d'ions (trajectoire instable) et donc perte de sensibilité Dans la pratique : gamme de masse jusque 4000 Da et résolution maximale jusqu’à 3000. En général, insuffisant pour résolution mono-isotopique, résolution unitaire = résolution suffisante pour distingué 2 masses différentes de 1 Da. quadripole = analyseur basse résolution Balayage à vitesse uniforme sur l'ensemble de la gamme de masse indépendant de l'énergie cinétique (au contraire du TOF). En mode RF : le quadripôle sert à focaliser la trajectoire des ions pour avoir une meilleure translmission
La trappe ionique La trappe ionique est constituée de 3 électrodes : un électrode annulaire en forme de diabolo deux électrodes quasi-hyperboliques Les ions entrent et sortent de la trappe par des orifices au niveau des électrodes chapeaux.
Les 5 éléments d’une trappe ionique Electrode annulaire Bagues d’isolation Electrode chapeau d’entrée Electrode chapeau de sortie
Schéma d ’un ES-trappe ionique Spray Cap. Skimmer Source ES Pompes à vide Octopole gaz : He électrode annulaire RF quadripolaire RF dipolaire Détecteur Trappe ionique Int. m/z Spectre MS N2 chauffé Esquire (HP, Bruker) Principe : les ions de différents m/z sont présents simultanément dans la trappe et on cherche à les expulser en fonction de leur masse pour avoir un spectre (≠ quadripôle : on règle les potentiels de manière à n’avoir qu’un seul m/z qui traverse les barres)
L’analyseur Trappe ionique : Résumé La trappe ionique fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire Dans la pratique : gamme de masse jusque 6000 Da et résolution maximale jusqu’à 5000. Trappe ionique = analyseur moyenne résolution Principale limitation : capacité de piégeage des ions Avantage : permet de faire de la MS multiple MSn n2 (pour le quadripôle n=2 seulement)
Nouvelle génération de trappe : piège orbital Orbitrap Makarov Oscillation axiale suit la relation Electrode extérieure en forme de tonneau, électrode centrale en fuseau Trajectoire des ions due à - rotation ωφ - oscillation radiale ωr - oscillation axiale ωz Spirales entremêlées autour de l’électrode centrale Fréquences déterminées par transformée de Fourier Résolution > 60 000 à m/z 400 Précision < 5 ppm Sensibilité sub-femtomolaire Vitesse 1 scan/sec à 60 000 resolution 4-5 scans/sec à 7 500 resolution 46 Thermo
Spectromètres de masse commerciaux: De nombreux couples source /analyseur sont possibles Q BE TOF IT FT-ICR EI/CI FAB MALDI/LD ES/APCI
La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions: Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle. On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion présent dans un mélange d’ion qui peut être très complexe L’ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision. Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments. C’est de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem) Si on répète l’opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS3 Certain appareils permettent de faire de la MS10 La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure
Principe de la MS/MS: étude d’ions fils Cellule de collision Source Détecteur Ion parent Ions fils Spectre MS/MS Ions Fragmentation (CID) Le premier analyseur ne balaye pas
Obtention d’un spectre de masse MS/MS m/z Intensité Spectre de masse MS m/z Intensité Sélection de l’ion parent (précurseur) m/z Intensité Spectre de masse MS/MS (fragmentation) Rupture des liaisons les plus fragiles Obtention d’informations structurales
Principe de fragmentation dans la chambre de collision (Collision Induced Dissociation : CID) Cellule de collision Mi, z m1 m2 m3 mg DV Ec = Elab = ze DV Ecm = Elab mg / Mi + mg
Les analyseurs MSn La MS-MS peut être réalisée par : La MS-MS peut être réalisée par : Deux quadrupôles Q-Q Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol Q-TOF Deux analyseurs à temps de vol TOF-TOF Un piège à ions (Ion Trapp) IT Une résonnance cyclotronique d’ion à transformée de Fourrier FT-ICR La MSn peut être réalisée par : Une résonnance cyclotronique d’ions à transformée de Fourrier FT ICR
Les énergies de la collision en MS/MS dépendent du type d’analyseur utilisé. On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées Collision haute énergie en keV EB/EB ou BEB EB/Q EB/TOF TOF/TOF TOF (PSD) Collision basse énergie en eV QQ Q-TOF IT FT-ICR
MS/MS pour un appareil de type Q-TOF
Analyse MS et (MS)n dans une trappe ionique Spectre (MS)n Accumulation des ions Fragmentation Excitation Isolation Détection Accumulation des fragments Int. m/z 5 2 4 3 6 1 Spectre MS
Nomenclature des fragments peptidiques Bieman, Roepstorff, Fohlmann an bn cn NH CH CO NH CH COOH Rn Rn+1 xn yn zn dn, vn, wn dn+1, vn+1, wn+1 Fragments observés en haute et basse énergie Fragments observés seulement en haute énergie
Spectre ESI-MS d’un digeste trypsique (m/z=681) 300 600 900 1200 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 x104 Intens. 371.1 391.26 462.14 529.35 543.37 577.29 618.22 622.86 681,33 720.30 778.42 756.82 809.97 864.96 887.36 1010.39 1076.29 1090.87 1223.54 MS/MS
ESI-IT-MS-MS de l’ion [M+2H]2+ à m/z=681 A G E I/L K D
Interprétation d’un spectre MS/MS Spectre MS/MS d’un peptide de masse 1738.6 sur l’ESI-trappe (doublement chargé à m/z = 869.8) A 71.0 E 129.0 I/L 113.1 G 57.0 56.9 F 147.1 E 129.0 T 101.0 T 101.0 S 87.0 G 57.0 Série Y Détermination de proche en proche d'un Tag
Interprétation d’un spectre MS/MS Série y GQ PA R Ion parent XXMEAWDGXXLLLFSDX GQ 185.08 D 115.01 D 115.03 I/L 113.06 I/L 113.09 W 186.08 PA F 147.06 I/L 113.12 G 57.00 S 87.00 168.05 A 71.09 E 128.92 M 131.00 MH+-H2O 920.46