Cours Spectrométrie de Masse La Désorption Ionisation Laser Assistée par Matrice : le MALDI Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Tel: 03 90 24 27 78 ssangli@chimie.u-strasbg.fr Cours ESBS Octobre 2005

L’ionisation laser assistée par matrice Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) - génère des ions à une seule charge MH+ (monochargé) - l’ionisation se fait sous pression - tolérance aux sels et détergents - principalement couplée à un analyseur TOF (Temps de Vol) : sensibilité : 10-15 - 10-18 moles résolution : 5000 - 10 000 en routine, précision : 20 ppm Première publication: Laser desorption ionisation of proteins with molecular masses exceeding 10000 Da, Karas M. and Hillenkamp F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)

L’ionisation électrospray : Règles d’ionisation des biomolécules en ESI - Ionisation positive (le voltage de source est positif) : Elle se fait souvent par protonation d’un site basique, par exemple sur un acide aminé comme K, R, (H) -NH3+ -NH2 - Ionisation négative (le voltage de source est négatif): Elle se fait par perte d’un proton, par exemple sur un acide aminé comme D, E L’ionisation négative est moins sensible que le mode positif. Souvent utilisée pour DNA et RNA -COOH -COO - Les peptides et protéines contiennent de nombreux groupes basiques ou acides qui peuvent recevoir des charges positives ou négatives

L’ionisation laser assisté par matrice: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) Le MALDI est basé sur l’utilisation d’un composé (la matrice) qui absorbe à 337 nanomètres L’analyte est dilué environ 10 000 fois dans cette matrice L’échantillon est introduit dans le spectromètre après complète évaporation des solvants. Il n’y a donc pas de couplage avec la chromatographie possible La source d’ions MALDI est principalement couplée à un analyseur à temps de vol (MALDI-TOF)

Principe de l’analyse MALDI-TOF Co-crystallisation d’une matrice et d’un échantillon Le dépôt cristallin est irradié par des impulsions laser Désorption et ionisation des molécules de matrice et de l’échantillon Accélération des ions formés dans un champ électrique en source Séparation des ions selon leur rapport m/z dans le tube de vol Détection des ions et mesure du temps écoulé entre un T0 et l’impact sur le détecteur

Principe de la désorption de l’échantillon Excitation des molécules de matrices par l’impulsion laser Laser + Ionisation et désorption de l’échantillon Co-crystallisation de l’échantillon et de la matrice photosensible L’impulsion laser provoque localement un échauffement du dépôt et de micro-explosions L’échauffement entraîne des collisions et le transfert de charges de la matrice à l’échantillon

1. Préparation du dépôt La qualité de l’analyse dépend en grande partie de la qualité du dépôt du couple échantillon matrice. Trois types de dépôts peuvent être utilisés dans l’analyse protéomique. - couche mince - goutte séchée - sandwich Le dépôt le plus fréquemment utilisé est celui dit en goutte séchée

Echantillon cristallisé Préparation du dépôt Dépôt en “couche mince” (“thin layer”) Matrice à saturation dans l’acétone H2O/TFA O,1% Protection du dépôt Dépôt de l’échantillon sur la goutte d’eau acide Dépôt de l’échantillon sur la matrice Echantillon cristallisé avec la matrice Echantillon déposé sur H2O/TFA O,1% Incorporation de l’échantillon dans les couches supérieures de la matrice

Dépôt en goutte séchée (“dried droplet”) 2. Préparation du dépôt Dépôt en goutte séchée (“dried droplet”) Matrice à saturation dans H2O/ACN Mélange Dépôt Echantillon Matrice Mélange direct sur la cible Echantillon Matrice Co-cristallisation échantillon matrice Matrice à saturation dans H2O/ACN diluée X3

Comparaison des deux techniques de dépôts Préparation du dépôt Comparaison des deux techniques de dépôts Avantages : Goutte séchée : rapide, résistant, lavage Couche mince : permet un lavage (sandwich), plus sensible ! Désavantages : Goutte séchée : mauvaise conservation Couche mince : conservation plus longue, nombre de tirs limités

Préparation du dépôt Dépôt de type Sandwich Couche de matrice à saturation dans l’acétone (0,5 µl) (Pain) H2O/TFA O,1% Protection du dépôt (0,7 µl) (Beurre) Echantillon (0,5-1 µl) (Jambon) Sur couche de matrice à saturation dans H2O/ACN (Pain)

Aspect de différents dépôt MALDI-TOF avec 1. Préparation du dépôt Aspect de différents dépôt MALDI-TOF avec l’a-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid Sandwich Goutte séchée Couche mince Goutte séchée 1/3

Préparation de l’échantillon L’analyse MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse qui est relativement tolérante vis à vis des composés qui accompagnent généralement l’échantillon à analyser. Cependant certains échantillons ne pourront être analysés qu’après un traitement préalable le rendant compatible pour l’analyse MALDI-TOF. La personne qui va réaliser l’analyse MALDI-TOF et qui n’est pas la personne qui a préparé l’échantillon doit poser un certain nombre de questions qui orienteront son choix pour la préparation de l’échantillon.

Préparation de l’échantillon Les questions : - type de molécule à analyser (choix de la matrice) - type d’échantillon (gel, liquide, poudre) - nature des solvants accompagnants l’échantillon - pH - présence de sels - présence de détergents Ces informations vont conditionner les traitements qui seront réalisés pour rendre l’échantillon compatible pour l’analyse MALDI-TOF

Aspect du dépôt sandwich en présence de composés non compatibles avec l’analyse MALDI-TOF pH 8 SDS ACN ACN trop concentré (>30%) Solubilisation de la matrice et obtention d’une goutte séchée après évaporation de l’ACN Analyse possible SDS 0,1% Formation d’une couche cristallisée de SDS Analyse impossible Tris HCl 0,1 M pH 8 Dissolution de la matrice due au pH basique de la solution. Analyse impossible

Elimination des sels par lavage direct du dépôt Il est possible de « dessaler » un échantillon sur cible par un lavage direct de l’échantillon à l’aide de 1 µl d’eau acidifiée par 1% de HCOOH. Ce type de lavage, sur un dépôt en goutte séchée ou en sandwich, permet un dessalage rapide de l’échantillon sans quasiment aucune perte. Les sels sont solubilisés par l’eau, les peptides restent cristallisés avec la matrices. H2O/HCOOH échantillon sels matrice

1. Préparation du dépôt Le choix de la matrice La matrice est un point important dans l’analyse. Son choix peut conditionner la réussite ou l’échec de l’analyse Caractéristiques de la matrice Petit composé organique, photosensible (cycle aromatique) Faible volatilité (10-7 mbar) Compatible avec le solvant de l’analyte (soluble) Bonne absorbance à la longueur d’onde du laser (337 nm) Capable de transférer une ou plusieurs charges à l’analyte (acide)

a-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid 2. Les matrices Trois matrices permettent de réaliser une grande partie de analyses surtout dans le domaine de la protéomique. 2,5-DiHydroBenzoic acid (DHB) a-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid (HCCA) Sinapinic Acid (SA) Absorbance à 337 nm Cristallisation aisée Solubles dans les solvants organiques

Matrices usuelles et types d’échantillons 2. Les matrices Matrices usuelles et types d’échantillons Matrice Type d’échantillon a-cyano (HCCA) Peptides / Protéines / Glycoprotéines Acide Dihydroxybenzoïque (DHB) Peptides / Peptides Glycosylés, Phosphorylés Polymères polaires / Glycannes Acide sinapinique (SA) Protéines / Glycoprotéines / Polymères polaires HCCA + DHB Peptides (Ref)

Structures d’autres matrices 2. Les matrices Structures d’autres matrices Caffeic acid 2,4,6- Trihydroxyacetophenone (THAP) (Oligonucléotides) Picolinic acid (PA) 2-(4-Hydrophenylazo)benzoic acid 3-Hydroxypicolinic acid (HPA) (Oligonucléotides)

Autres matrices et types d’échantillons 2. Les matrices Autres matrices et types d’échantillons Matrice Type d’échantillon Oligonucléotides THAP Oligonucléotides HPA Polymères apolaires / Molécules organiques diverses Dithranol Le point commun entre l’ensemble de ces différentes matrices est la présence d’un noyau aromatique ainsi que leur caractère acide.

Type d’échantillon L’échantillon peut se présenter sous trois formes - Solide (poudre, cristal) - Liquide (solution) - Gel (électrophorèse) La forme sous laquelle se présente l’échantillon va orienté son mode de préparation pour l’analyse MALDI-TOF. Généralement, les échantillons destinés à l’analyse « protéomique » se présentent inclus dans un gel. L’échantillon sous forme de gel est le plus facile à traiter. L’échantillon sous forme liquide réserve souvent des surprises et nécessite un traitement qui peut être plus difficile.

L'ionisation MALDI est, par principe, naturellement couplée à un analyseur à temps de vol (TOF). 20 kVolts 0 volts Départ: Formation des ions par un bref tir laser (5 nano sec.) Détection: Mesure du temps écoulé depuis le départ des ions Zone de vol libre d’accélération Zone d’accélération Cible

Analyseur à temps de vol source détecteur Ions positifs (m/z) -20 kV V = + 30 kV d La mesure du temps permet de calculer m/z, et donc la masse

Le mode linéaire permet d’analyser les masses élevées MALDI - LR linear mode - intact protein mixture Myoglobin Cytochrome c Trypsinogen

Différents modes de fonctionnement d’un spectromètre de masse à temps de vol 1- Le spectromètre de masse à analyseur TOF peut travailler: - sans réflectron (mode linéaire) - avec réflectron - avec ou sans extraction retardée des ions 2- Selon le mode de fonctionnement choisi (4 combinaisons possibles) les performances seront différentes pour: - la résolution - la sensibilité - la mesure des masses moléculaires élevées

Extraction retardée Lentille 2 0 kV Lentille 1 15 kV 20 kV Cible

0 kV 15 kV 20 kV Extraction retardée Bref tir laser (3 à 7 nano sec) Lentille 2 0 kV Bref tir laser (3 à 7 nano sec) Lentille 1 15 kV Plasma 20 kV Cible

0 kV 15 kV 20 kV Extraction retardée Vers le TOF Lentille 2 0 kV Lentille 1 15 kV Ions avec des énergies Cinétiques dispersées Et des t0 différents 20 kV Cible

0 kV Extraction retardée 20,5 kV 20 kV Extraction retardée Vers le TOF Lentille 2 0 kV Extraction retardée Lentille 1 20,5 kV Ions avec des t0 resynchronisés 20 kV Cible

L’extraction retardée Potentiel lentille 2 (K volts) 20,5 15 Délai Temps Tir laser 2em départ (synchronisé) Le délai doit être optimisé (50, 100, 300 nanosecondes) en fonction des masses moléculaires étudiées (gamme 5000, 20000, 100000 daltons). Délai permet une focalisation en temps. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry M. L. Vestal, P. Juhasz, S.A. Martin, Rapid communication in mass spectrometry 9, 1044-1050, (1095)

Le réflectron permet d’augmenter la résolution source réflectron - 3 kV 130 V V = + 3 kV Ions positifs (m/z) -20 kV Il y a focalisation en énergie cinétique et allongement du tube de vol détecteur

Un appareil MALDI-TOF linéaire avec DE MALDI LR-Linear mode (Micromass) Effective flight path = 1.0 m

Un appareil MALDI-TOF à réflectron avec DE MALDI-LR Dual Detector Reflectron mode (Micromass) Effective flight path = 2.3 m

Réflectron

Influence du reflectron sur la résolution M@LDI-LR Dual Detector Reflectron mode (Micromass) Linear mode ACTH resolution >7000 FWHM Reflectron mode ACTH resolution >15,000 FWHM

Avantages apportés par le réflectron et par l'extraction retardée.

Spectre de masse MALDI des glycopeptides 16-36 et 17-36 de la sous-unité b de la hFSH

Méthodologie MALDI-MS de détermination de la spécificité d’une enzyme

Méthodologie MALDI-MS de détermination de la spécificité d’une enzyme

Spécificité de la cathepsine G sur la chaîne B oxydée de l’insuline bovine

Spectre de masse MALDI de l’aérolysine heptamère : MM = 334 900 Da

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel « Digestion in gel » prélèvement du spot lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) X 3 déhydratation par de l’ACN réduction DTT (57°C 45 min.) alkylation Iodoacétamide (30 min.) lavage ACN lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) X 2 digestion enzymatique (12 H 37°C) NH4HCO3 : 25 mM (98,5 mg/50 ml) DTT : 10 mM (15,4 mg/10 ml) Iodoacétamide : 55 mM (102 mg/10 ml) Trypsine Proméga V5111 : 12,5 ng/µl

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel « Digestion in gel » Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) (10 min) Déhydratation ACN Réduction (57°C_45 min) Alkylation (25 min) Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) (10 min) Déhydratation ACN Digestion à la trypsine (37°C, 12 heures)

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel « Digestion in gel » La digestion « in gel » est une technique relativement simple, ce n’est qu’une succession de lavages, mais des précautions sont tout de même indispensables. Le risque principal est la présence de protéines contaminantes en concentration supérieure à celle de la protéine à identifier. Le principal contaminant est la kératine qui est une protéine présente au niveau de la peau, des cheveux, des pulls … Il est possible d’éviter cette contamination par la kératine en prenant quelques précautions lors du traitement de l’échantillon

Spectre MALDI-TOF d’un digeste trypsique d’ADH (100 fmol ADH) Goutte séchée 1/3 Résolution Isotopique Résolution : 12739

Liste des masses mesurées par MALDI-TOF La “peak liste” est utilisée pour faire les recherches dans les banques de données par le biais de différents moteurs de recherche (MS-Fit, Mascot, GlobalServer, Profound, PeptideSearch,…) Identification

Résultats de la Recherche MASCOT

A retenir à propos de l’ionisation par MALDI 1 - Le MALDI génère des ions monochargés. 2 - L’ionisation par MALDI est très douce. On observe que les ions moléculaires ne fragmentent pas. 3 - Le MALDI n’est pas compatible avec le couplage LC-MS 4 – Les spectromètres de masse MALDI-TOF sont très sensibles (femtomoles voire attomole) 5 – MALDI utilisé en analyse protéomique pour l’obtention de cartes peptidiques massiques (« peptide mass fingerprinting »)