Profil de Croissance Virale Éclipse Temps # de virus Infection Latence Lyse Rendement de lyse

Rendement de Lyse Définition du rendement de lyse: Paramètres: No de virus générés par une cellule infectée suite à un cycle infectieux complet Paramètres: La multiplicité d’infection (M.I.) est No de virus infectieux disponible par cellule La M.I. sert aussi à déterminer le No de cellules infectées

Multiplicité d’Infection Nombre de virus = 4 M.I. = 4/6 = 0.67 Ou 4 sur 6 cellules seront infectées Nombre de cellules = 6 3 3

Multiplicité d’Infection Nombre de virus = 10 M.I. = 10/6 = 1.6 Ou 6 sur 6 cellules seront infectées Nombre de cellules = 6

Calcul de la M.I. 108 cellules sont exposées à 104 virus Quelle est la multiplicité d’infection? 104/108 = 10-4 Virus/cellule Combien de cellules seront infectées? 104 cellules seront infectées Combien de cellules restent non-infectés? 108-104 = approx. 108 cellules (et non 104)

Calcul du Rendement de Lyse Nombre de virus produit =10 Ou 10 virus/4 cellules Donc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule Nombre de cellules infectées = 4

Calcul du Rendement de Lyse M.I.=0.0001; # de cellules = 108 ; Après 10 heures il y a 106 virus Quel est le rendement de lyse? 0.0001 virus/cellule x 108 cellules = 104 virus ensuite le rendement de lyse est 106/104=100 virus/cellule Quelle est la multiplicité d’infection après le premier cycle infectieux? 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.0001 x 100 = 0.01.

Calcul du Rendement de Lyse (suite) Quelle est la multiplicité d’infection après le deuxième cycle infectieux? 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 = 1 Quelle est No de cycle infectieux total? 3 cycles Combien de virus sont produit à la fin du dernier cycle infectieux? Rendement x nombre total de cellule = 100 x 108

Énumération et Typage des Virus Compte direct Détermine nombre de virus totaux Essai de plages Détermine nombre de virus infectieux Essai d’hémagglutination Détermine nombre total de virus Possible seulement avec les virus hémagglutinant Qui possède l’hémmaglutinine – Ex. influenza Infectieux et non infectieux Essai d’inhibition d’hémagglutination Typage antigénique de virus hémagglutinants

Comptes Directs Coloration négative Microscopie électronique Ne distingue pas particules infectieuses de non-infectieuses Utile pour les virus qui ne peuvent pas être crus en laboratoire Utilise des billes à une concentration connue pour estimer le volume du champ de vision 10

Comptes Directs Viraux Ajouter billes (104/mL) Observer au microscope 10 billes dans un champ Donc un champ = 1µL 21 virus dans un champ Donc 21 virus/1µL = 2.1 X 104 virus/mL

Essai de Plages Infecter monocouches de cellules ou tapis bactériens avec différentes dilutions de virus Déterminer le nombre de plages pour chaque dilution Chaque plage est le résultat d’une seule cellule infectée par une seule particule virale 1 UFP

Les Plages Effet cytopathique localisé Lyse cellulaire Chaque plage représente un foyer d’infection Chaque foyer d’infection est initié par une cellule infectée

3.3 X 106 UFP/mL 330 33 3 33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4 Facteur de dilution 9 mL milieu Préparation virale 3.3 X 106 UFP/mL 33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4 Donc le titre de la suspension originale est:

Essai d’Hémagglutination Mesure de la quantité minimale de virus requise pour agglutiner les globules rouges 1 unité d’hémagglutination (UHA) Hémagglutination partielle Hémagglutination complète Pas d’hémagglutination ≥1UHA < 1UHA 0 UHA

Essai d’Hémagglutination 1:8 1:8 Titre = 32 UHA 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 virus Dilution 8 8 16 16 32 32 64 64 128 128 256 256 Mélanger avec globules rouges Vu de côté Vu du haut

Essai d’Inhibition d’Hémagglutination Anticorps anti-virus présent Anticorps anti-virus absent Ac lie le virus Liaison du virus au GR inhibée Virus lient GR Hémagglutination Hémagglutination inhibé

Points importants à connaître Cours_08 Nov 2013 Les cellules sanguines Connaître les noms Leur origine Les fonctions Lieu d’action Phagocytose (les différentes étapes) Les deux cascades du complément (en détail) Alterne MB-Lectine (MBL) Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades Comprendre comment les antigènes sont présentés aux Lymphocytes

Cellule souche hématopoïétique Cellule myeloïde progénitrice Cellules sanguines Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes Cellules qui relâchent des granules Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse inflammatoire Neutrophile Cellule phagocytaire (cellules qui mangent) Une concentration élevée indique d’une infection Normalement ils restent dans système sanguin Mais vont dans les tissus seulement s’il y a infection dans le tissu Éosinophile Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes) Combats les infections parasitiques Impliqué dans les réactions allergiques Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus) Initie et amplifie la réponse inflammatoire

Cellule souche hématopoïétique Cellule myeloïde progénitrice Cellules sanguines Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

Leucocytes Non Granulaires Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique Cellules phagocytaires Relâchent les initiateurs de la réponse inflammatoire Fait appel au système adaptatif (la 3ème ligne) Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ou cellules professionnelles Molécule présentatrice - CMHII Cellules NK Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales

Cellule souche hématopoïétique Cellule myeloïde progénitrice Cellules sanguines Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

Processus de la Phagocytose Reconnaissance PRR (TLR) – PMAP Opsonines Ingestion Formation de phagosome Fusion avec lysosome Phagolysosome Digestion/Destruction Enzymatique & Chimique Expulsion

Phagocytose - Conséquences Digestion enzymatique Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases, Nucléases Destruction oxydative par radicaux libres Superoxide dismutase : 2O2- + H2O à H2O2 + O2. Myéloperoxidase: Cl- + H2O2 à hypochlorite (javel) Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire Synthèse et sécrétion de cytokines Présentation sur CMHII (CPA seulement)

Cellules NK Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules sauf les neurones et les globules rouges Tue cellules qui n’ont pas ou peu de CMHI Cellules infectées par des virus Cellules cancéreuses Deux récepteurs de surface Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur activateur) Interagit avec CMHI des cellules nucléées Récepteur activateur Interagis avec glycoprotéines induites par le stress

Action des Cellules NK Récepteur inhibiteur CMHI Cellule NK Cellule Survie Protéine activatrice Récepteur activateur Cellule Infectée NK Cellule Infectée

Cascades du Complément La réponse innée comporte deux cascades Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand): Implique une collection de protéines sériques (libre dans le serum et inactives) Protéines du complément: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 Protéines accessoires: B et P Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez les bactérie (Voie MBL) Protéases: MASP-1 et MASP-2 Initié par la liaison à des composantes communes à une grande variété de bactéries: Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules

Bactérie Gram Négative Voie Alterne C3 + H2O + C3b C3a C5a C5b + C3 C3b C3a C5 Ba Complexe CAM C3 Convertase C5 Convertase C5b C9 C9 C9 C3b Bb B P C3b C9 C9 C9 C9 C6 C7 C8 C9 C9 Bactérie Gram Négative 29

Voie de la MB-Lectine C3 C5 C3b C6 C7 C8 Capsule Bactérienne C5a C4a + MASP2 C2 MASP1 MASP2 C4b MBL C3 C4b C3b C3a C5b C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C2a C6 C7 C8 Capsule Bactérienne 30 30

Conséquences des Voies du Complément Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes doivent être détruits) Liaison de C3b et C4b sur la bactérie Bactéries, virus et parasites Anaphylatoxines (des alarmes) C3a et C5a Activent granulocytes et monocytes Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire Dégranulation Recrutement des autres cellules dans la région CAM (pore) Lyse osmotique Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme d’atteindre la paroi Parasites – Perte de solutés

Présentation & Activation La présentation par les CPA est faite seulement aux lymphocytes Ta Reconnaissance par les paratopes des RCT appropriés des lymphocytes Ta Les CPA sécrètent des cytokines activatrices (substances solubles que agissent sur d’autres cellules) Amplification clonale des Ta qui sont sélectionnées Donc la réponse acquise est initiée!

Lymphocytes TA Récepteur cellulaire – RCT Reconnaissance d’épitopes non-soi présenté par le CMHII Modes d’action: Sécrétion de cytokines pour Activer d’autres lymphocytes (Tc, B) et les CPA (Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique) RCT TA CD4

Lymphocytes TA Un Lymphocyte TA possède des RCT avec un paratope capable de reconnaître un épitope associé au CMHII Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute sa vie Elle ne pourra pas reconnaitre d’autres épitopes Pour reconnaître un autre épitope on a besoin d’un autre lymphocyte TA avec un paratope spécifique pour ce nouvel epitope C’est la raison pour laquelle on a un répertoire élevé

Présentation aux Cellules TA CD4 CMHII TA CD4 CPA CD4 TA RCT Paratope CD4 TA Amplification clonale CD4 TA

3e Ligne-Le Système Adaptatif Caractéristiques: Spécifique Acquiert une mémoire après une première rencontre Capable d’apprendre et de s’améliorer suite à des infections subséquentes Contrairement ou système innée il fait la discrimination entre le “soi” et le “non-soi”

Deux Fronts Extracellulaire Intracellulaire Réponse Humorale Antigènes exogènes: Bactéries Virus Mycètes Parasites Toxines Intracellulaire Réponse Cellulaire Antigènes endogènes: Quelques bactéries Ex. Mycoplasmes Mycobactérium Virus

Participants Cellulaires CPA Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules dendritiques Lymphocytes Ta (T auxiliaire) TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène) TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène) Lymphocytes B Réponse Humorale (contre antigène exogène) Lymphocytes Tc Réponse cellulaire (contre antigène endogène)

La Réponse Humorale Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un épitope de l’antigène C’est la sélection clonale Si l’antigène se lie à la RCB, l’endocytose du complexe RCB-Ag se fait Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag Présentation d’épitopes complexés sur le CMHII à des cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées Donc c’est la deuxième fois que la TH2 se fait présenter l’Ag La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B Ensuite l’activation du lymphocyte B fait l’amplification clonale et se différence en plasmocytes et cellule B mémoire

Lymphocytes B Un Lymphocyte B possède un RCB capable de reconnaître un épitope avec un paratope Le RCB est formé de 2 isotypes d’anticorps IgM & IgD membranaire C’est une molécule présentatrice Donc elle possède un CMHII Les lymphocytes B secrètent aussi des molécules effectrices (Anticorps) 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE RCB IgM & IgD membranaire Y

La Réponse Humorale Les plasmocytes secrètent des anticorps Une cellule peu seulement produire des anticorps avec un paratope (le même paratope que la cellule mère) Elle ne peut pas changer le paratope ni l’épitope qu’il reconnait Les cellules B mémoire gardent une mémoire pour l’épitope Cela fait aussi que la représentation de cette cellule est plus grande Donc la prochaine réponse est plus rapide

Y Y La Réponse Humorale Y TH2 Activation Épitopes CMHII RCB: IgM ou IgD Cytokines Y TH2 Activée Y Y Activation Y Y Antigène Y Répertoire de lymphocytes B Naïf Y Y P Plasmocytes M B Mémoires Amplification clonale et différentiation Y Y Sécrétion d’Ac

Les Anticorps (Immunoglobulines) Idiotype Sites de liaisons d’épitopes antigéniques Chaîne lourde 2 X Fab 1 X Fc Région variable Région constante Liens disulfures Chaîne légère Région variable Région constante Isotype

Les Anticorps (Immunoglobulines) Fab (Fragment Antigen Binding) Région responsable de la reconnaissance de l’épitope N’est pas responsable de la fonction Fc (Fragment constant) Région responsable de la fonction N’est pas implique dans le reconnaissance

Immunoglobulines - Cinq Isotypes IgD IgM IgG IgA IgE Les cellules B peuvent produire 5 isotypes (Le mode d’action des Ac est déterminé par l’isotype) Mais seulement 1 idiotype (resposable de la reconnaissance de l’epitope) Déterminé par la région Constante Confère fonctionnalité

IgD Monomère valence de 2 Ac exclusivement membranaire Peut reconnaitre 2 molecules d’un même epitopes Ac exclusivement membranaire Pas secrété Ac de surface des cellules B Represente le RCB

IgM Pentamère (valence de 10) Anticorps de surface RCB Forme membranaire mais peut être secrété Premier Ac sécrété Fixation du complément Agglutinant Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK

IgG Monomère (valence de 2) Ac sérique prédominant Plus abondant dans le sérum Le seul que peut traverser le placenta Donc peu protéger le fétus Fait la fixation du complément Région Fc est une opsonine Reconnue par phagocytes Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK

IgA Dimère (valence de 4) Principalement associé aux muqueuses Dans les orifices (la bouche, le nez, l’anus, etc..) Neutralisant et agglutinant

IgE Monomère Secrété par les lymphocyte B Leurs régions Fc se lient aux membranes des macrophages, basophiles et mastocytes Deviennent donc des Ac membranaires Impliqué dans les réactions allergiques Ces cellules du système innée acquièrent des récepteurs qui les rendent spécifiques

Modes d’Actions des Anticorps Agglutination Neutralisation Opsonisation ADCC Dégranulation des macrophages Fixation du complément Voie classique du complément IgM et IgA IgM, IgA et IgG IgG et IgM IgE IgM et IgG

Agglutination Favorise la phagocytose Inactive l’envahisseur

Neutralisation Liaison à des composantes essentielles causant l’inactivation

Opsonisation par IgG ou IgM Régions Fc d’IgM et d’IgG sont des opsonines reconnues par les cellules phagocytaire Le lysozyme tue toute les cellules dans l’environnement

ADCC Régions Fc d’IgM et d’IgG sont reconnues par des récepteurs des cellules NK La destruction est ciblée (tue les cellules ciblées)

Dégranulation des Mastocytes par les IgE Allergène Y Y Y Granules de médiateurs préformés IgE Y Lysosome Récepteur de région Fc

Voie Classique du Complément 4b + C2 C4 C2a C2b + C5a C5b + C3b C3a + Complexe C1 C3 C5 C1q C5 Convertase C3 Convertase C1r C1s Y C 4b C3b C2a C5b C9 C9 C9 C9 C9 C9 C9 C6 C7 C8 C9 C9 Antigène (pas nécessairement une bactérie)

Conséquences de la Voie Classique Opsonisation C3b & C4b Analphylatoxines C3a & C5a CAM Lyse osmotique

Décours de la Réponse Humorale 0 7 14 >30 Jours après l’exposition Nombre de cellules B Spécifiques à l’antigène Reconnaissance Présentation B naïve B activé Expansion Clonale Activation Élimination Immunité Mémoire B mémoire Rencontre avec Ag

Réponses Immunes: 1re et 2e Rencontres Élément Réponse primaire Réponse secondaire Réponse maximale Plus faible Plus forte Isotype d’Ac Habituellement commence avec IgM ensuite passe à IgG Augmentation des IgG (on passe directement à IgG) Nombre d’antigène requis Relativement élevée Faible Latence Entre 10-21 jours Entre 1-3 jours

Types d’Immunités Humorales Naturelle Artificielle Active Passive Active Passive

Immun. Acquise Naturelle Active/Passive Exposition naturelle à l’antigène En général se fait de façon naturelle Ex. Une infection Défense humorale active: L’individu monte ses propres défenses Mémoire acquise Défense humorale passive: Réponse humorale chez hôte 1 Transfert naturel des Ac de hôte 1 à hôte 2 Pas de mémoire acquise Ex. IgG transmit dans le lait maternel

Immun. Acquise Artificielle Active/Passive Exposition artificielle à l’antigène En général se fait avec intervention humaine Ex. Vaccination, transfusion Défense humorale active: L’individu monte ses propres défenses Mémoire acquise Défense humorale passive: Réponse humorale chez hôte 1 Transfère artificiel des Ac à un autre hôte Ex. Les antivenins; générés chez les chevaux et administré à l’homme Aucune mémoire acquise

Réponse Acquise à Médiation Cellulaire Pour des antigènes endogènes Ag fabriqués à l’intérieur de la cellule Ex. une cellule infectée par un virus et qui fabrique les protéines du virus à l’intérieur Tout les antigènes endogènes sont présentés sur le CMHI Le CMHI présente les antigènes aux lymphocytes Tc

Réponse Acquise à Médiation Cellulaire Choisir un lymphocyte Tc avec un RCT qui à le bon paratope pour reconnaitre un épitope de l’antigène associé au CMHI d’une cellule infectée Sélection clonale Activation du lymphocyte Tc Armement par cellules TH1 préalablement activées Reconnaissance par RCT approprié d’épitopes complexés au CMHII de CPA Amplification clonale Tuer cellule infectée

Lymphocytes Tc Récepteur cellulaire – RCT Tc naïfs doivent être armés CD8 Récepteur cellulaire – RCT Reconnaissance du non-soi présenté par CMHI Un lymphocyte Tc possède un RCT capable de reconnaître un épitope associé au CMHI Tc naïfs doivent être armés Deux signaux sont requis : Reconnaissance par un RCT d’un épitope spécifique associé au CMHI Cytokines activatrices produites par TH1

Réponse à Médiation Cellulaire Habituellement initié par cellules dendritiques Associées aux tissus connexes aux surfaces externes Poumons, peau, tractus gastro-intestinal, etc. Possède des récepteurs qui permettent l’infection par la majorité des virus Expriment CMHI( ) et CMHII( ) Font la présentation d’antigènes exogènes et endogènes

Réponse à Médiation Cellulaire Infection Tc CD8 Présentation d’épitopes endogènes sur CMHI Tc CD8 Présentation d’épitopes exogènes sur CMHII TA CD4 TA CD4 Reconnaissance par RCT de TH1 - activation Phagocytose Reconnaissance par RCT de Tc - armement Tc CD8 Amplification clonale de Tc armée

Attaque par les Cellules TC Armées

Survol des Réponses Immunes Acquises Réponse humorale Réponse cellulaire Antigène Phagocytose par CPA Présentation d’épitopes Infection cellulaire Activation de cellule T auxiliaire Endocytose par cellule B Cellule T auxiliaire activée Cellule T cytotoxique Cellule T cytotoxique activée Plasmocytes Anticorps Tuer

Interaction des Systèmes Innée et Acquis Immunité Innée Barrières Physiques Cellules Barrières Chimiques Granulocytes Monocytes et Macrophages Cellules NK Cytokines Cytokines Anticorps Cytokines Lymphocytes B Lymphocytes T Immunité Acquise