Analyse d’un article scientifique La voie de signalisation «B-caténine» de la wnt dans le cortex des mammifères Analyse d’un article scientifique Fait par: CHALAL Ikram TIAIBA Imene CHOUKRANE Thilelli AIT BELKACEM Maya ALLAM Karima M1 GD 2013-2014

Résumé

Introduction

Le cortex cérébrale des mammifères Le siège principal des fonctions cognitives Le développement du cortex cérébrale des mammifères passe par des stades précoces: Dérive de la partie dorsale du télencéphale 1er stade: Division symétriques des cellules progénitrices neuroépithéliales donnant une population de neuroprogéniteurs cellules gliale radiales (division asymetrique) Nécessite des signaux inductifs et des facteurs de transcription: Pax6 : favorise la production de neurones durant la division asymétrique des progéniteurs RGC. Neurogenins ( Ngn1 / 2): essentiels pour l'engagement de la lignée neuronale Tbr2 : Génère des neurones pour les couches corticales supérieures.

La wnt Historique : Molécules sécrétées par les cellules Régulent de nombreux processus de développement y compris la prolifération des cellules de l’hippocampe Signaux Wnt sont médiés par plusieurs voies intracellulaires: La voie canonique de la β - caténine , présente dans un gradient médio-latérale et contrôle la prolifération des cellules β –caténine. Historique : La signalisation β -caténine favorise la différenciation et détermine le destin du SNC (Ciani and Salinas, 2005) Au cours de la corticogenèse , un gradient de Fgf8 , Pax6 est Wnt dépendant (Grove et al., 1998 ) Expansion des progéniteurs est réglementé par la signalisation canonique Wnt (Lee et al , 2000; . Galceran et al, 2000 ; . Machon et al , 2003) Dans le développement du néocortex et la moelle épinière, le contrôle de la prolifération des cellules β -caténine est régulée par le cycle cellulaire dans les progéniteurs ( Chenn andWalsh , 2002; 2003; Megason et McMahon , 2002; Zechner et al , 2003

Problématique et suggestions Exemples pour prouver que les signalisation de la Wnt peuvent déclencher des processus cellulaires contradictoires selon le stade de développement et selon différents gradients: La signalisation antérieure exprimant Fgf8 établit l'axe antérieur-postérieur dans le cortex qui est contrecarré par le gradient de Emx2 Le gradient de Pax6 de la partie antérieure et le pôle latéral avec le gradient inverse de Emx2 Signalisation Wnt est en partie médiée par Emx2 Wnt -dépendant nécessaire pour le développement hippocampique. Les signaux Wnt canoniques sont transmis par l'intermédiaire d' Emx2 Emx2 qui régule positivement la voie Wnt But du travail Etude des ressources génétiques et les événements qui précédent la différenciation des progéniteurs dans les neurones. Montrer que le gradient affaiblit progressivement l’activité canonique de la Wnt qui contrôle initiation de la neurogenèse par règlement des gènes connus (neurogenes) La fonction de Wnt dans la cellule et la détermination de son destin au cours de la neurogenèse corticale est largement inconnue , les données du travail suggèrent que le gradient détermine l’identité cellulaire de wnt le long de l'axe latéro- médial durent le développement du télencéphale dorsal

Materiels et methodes Matériels biologiques: Animaux: Souris transgéniques « D6-CLEF », créés au Centre transgénique norvégien par injection de pronucléus d'une construction de plasmide dans lequel le domaine d'activation de β-caténine est liée au gene LEF-1 de fusion qui a été couplé à un promoteur D6 Souris rapporteurs Wnt BAT-Gal: utilisées pour cartographier l'activité Wnt chez les souris normales et pour surveiller l'activité ectopique dans les croisements D6-CLEF/BAT-Gal. Souris D6-CRE: Utilisée pour l’activation conditionnelle et l'inactivation de la voie Wnt canonique, Souris transgeniques avec loxP-flanked exon3 ou exons (2-6) sur le gène de la β-caténine ont été croisées pour les D6-Cre. Souris transgéniques avec loxP-flanked Pax6 pour inactivation conditionnelle de Pax6 ont été croisées pour les D6-Cre.

Méthodes Immunohistochimie Coupes de tissus congelés de 8 um d'épaisseur ont été perméabilisées à 0,1% de Triton X-100 dans du PBS et saturées dans 5 % de BSA et sérum de chèvre de 5%. Incubation toute une la nuit dans la solution d' anticorps primaire (0,5 % de BSA, du sérum de chèvre 0,5% , 0,1% de Triton X-100 dans du PBS) . Pour certains anticorps , petite ébullition de sections dans 0,01 M tampon de citrate était nécessaire. Coloration des anticorps secondaires a été effectuée pendant 30-60 min . Les anticorps primaires : lapin anti- Pax6 , de lapin anti- β -caténine, de lapin anti- TBR1 , de lapin anti- tbr2, de lapin anti- Meis2 , de lapin anti- Prox1, de lapin anti- Sox2. Anticorps secondaires : anti-souris ou anti-lapin ALEXA594 ou 488 Les noyaux ont été visualisés par 4,6- diamidino -2- phénylindol ( DAPI , Roche, 0,1 pg ml -1). Les images de fluorescence ont été obtenus par un microscope Axioskop2 (Zeiss ) en utilisant un logiciel Axiovision . Les images électroniques ont été traitées à l'aide Adobe Photoshop et le logiciel illustrator.

L'hybridation in situ Sur cryosections de 8 um d'épaisseur, réalisée selon des protocoles standards, incubées pendant la nuit à 68 ° C. Plasmides pour sondes antisens ont été aimablement fournies: KA1, Ngn2, VGLUT2 et Neuropilin-2 (NP2) La coloration de l'acétylcholinestérase

Résultats « La signalisation canonique de la Wnt se retire progressivement de l’ébauche du néocortex » Activité de la Wnt dans la paroi médiane est bien décrite car plusieurs Wnt sont exprimés dans la paroi corticale médiane. Pour surveiller un caractère dynamique de cette activité canonique de la Wnt dans le télencéphale en développement, nous employons la souris BAT- Gal transgénique où plusieurs sites de liaison TCF sont couplés à un promoteur minimal hétérologue qui commande l'expression d'une β -galactosidase ( β -gal ) gène rapporteur. Ainsi, l'expression de de β -gal reflète l'activité de signalisation canonique Wnt . Quand la protéine β -gal est très stable et persiste dans un tissu après la cessation de son expression , la mesure de son activité enzymatique peut ne pas refléter l'activité Wnt canonique en temps réel ( Fig1). C'est pourquoi nous avons effectué une hébridation in situ avec une ribosonde β -gal sur des coupes de tissus à partir de télencéphale de souris BAT- Gal. Signalisation Wnt est fortement actif dans de larges zones de la tête développement à E8, avant la fermeture du tube neural (figures 1A- C ). Alors que l’activité de la Wnt a été détectée dans le télencéphale dorsal , y compris la