Analyse de liaison, dose-effet 2 sites différents, coopérativité positive?

Of Cours 3

Courbes dose-effet, courbes de liaison Of Cours 3

Of Cours 3

Calcul de la EC50 et de la IC50 Of Cours 3

Of Cours 3

Conclusion: La EC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot La IC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot Si on mesure dans les mêmes conditions d’incubation la courbe de liaison et la courbe dose effet, EC50 et IC50 doivent être identiques. Of Cours 3

Liaison ligand-récepteur : rappel Compétition: Saturation: Of Cours 3

Liaison « coopérative » Of Cours 3

Correspondance IC50-EC50 absolue? Voir fichier « Excell »! (« Binding-Effet.xls ») Of Cours 3

Structures des récepteurs et activation Une ou plusieurs conformations actives?

Familles de récepteurs Transmembranaires: Canaux ioniques contrôlés par les ligands Signalisation très rapide, plusieurs Sous Unités(4-5),plusieurs TM (4-5 par sous unité) G-protein coupled receptors Signalisation rapide (msec), 7 TM, vraisemblablement dimères Récepteurs à activité enzymatique ou recrutant des enzymes 1TM dimères ou multimères Nucléaires et cytoplasmiques Protéines solubles, Homo- or hétéro-dimères Of Cours 3

Canaux: Au moins 3 “super families” avec plusieurs hélices TM Vraisemblablement: 3 Sous Unités 4 Sous Unités 5 Sous Unités Of Cours 3

Récepteurs canaux ioniques 2 (ou 3) états: Ouvert Fermé Désensibilisé

Récepteurs de l’acetylcholine (nicotinique): Canal Na+, ouvert en réponse à la liaison d’ AcetylCholine 5 Sous-Unités, chacune 4 hélices TM Of Cours 3

Liaison, effet biologique R AcCh R Glycine Of Cours 3

Deux ou trois états? (α7-AcChR-L247T) (α7-AcChR-wt) Of Cours 3

Effecteurs allostériques? Reconnaissent de préférence état ouvert et le stabilisent Reconnaissent de préférence état désensibilisé et augmentent l’ouverture Effet sur la liaison d’agoniste? Of Cours 3

1 2 3 4 Of Cours 3

Extracellular ring Intracellular ring d b 2 E/Q Extracellular ring L Gate Central ring (selectivity filter) S Intermediate ring E/Q D Of Cours 3 Intracellular ring

Acetylcholine Binding Protein: empty or antagonist-bound Of Cours 3

Acetylcholine Binding Protein: empty or agonist-bound Of Cours 3

Structure 3-D Récepteur AcCh Of Cours 3

Of Cours 3

Acetylcholine Binding Protein AcChol AcChol AcChol AcChol AcChol Of Cours 3

Activation of acetylcholine R Of Cours 3

Conclusion: Nombre limité de conformations: ouvert, fermé, désensibilisé La conformation ouverte est « sur le chemin » entre la conformation fermée et désensibilisée. Le passage direct entre la conformation fermée et la conformation désensibilisée semble (généralement) très improbable. (forte barrière énergétique?) Of Cours 3

Récepteurs cytosoliques et nucléaires Conformation dépendante du ligand (“Main dans un gant”)

GR HSP90 p59 Protein synthesis Preinitiation complex Of Cours 3

Structure modulaire: Of Cours 3

Two mechanisms of ER transcriptional activation Direct (Binding to ERE) TFIIH TFIIF RNAPII TFIIE TFIIB TFIID TFIIA ER TBP ERE TATA Indirect (Binding to other TF’s) PCAF ER TFIIH TFIIF CBP/p300 RNAPII TFIIE TFIIB TFIID TFIIA c-Jun c-Fos Sp1 Sp1 TBP AP1 GC TATA Of Cours 3

DNA Binding? Major groove Minor groove Of Cours 3

DNA Binding domain: Of Cours 3

Ligand Binding Domain: Of Cours 3

Estrogen-receptor recognition: Of Cours 3

Empty, inactive and active ligand-bound receptors Laszlo Nagy and John W.R. Schwabe, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.29 No.6 June 2004 Of Cours 3

Cinétiques de liaison? Courbes dose-effet? Albers et al, JBC 2006 Of Cours 3

Conclusion: Il y a autant de conformations « actives » que de ligands L’activité biologique de chaque ligand dépend de l’affinité relative des coactivateurs et des corépresseurs pour le complexe ligand-récepteur. Un composé peut être agoniste partiel soit parce qu’il reconnaît les coactivateurs avec une mauvaise affinité, soit parce qu’il reconnaît également coactivateurs et coinhibiteurs Of Cours 3

Récepteurs de l’insuline Tyrosine kinase, 1 TM helix; Coopérativité négative, Relations liaison – activation?

Courbes de compétition, de saturation 1 site ou 2 sites ? Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725 Of Cours 3

Cinétique de dissociation avec ou sans excès d’insuline Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725 Of Cours 3

Insulin Receptor α – Binding β – tyrosine kinase Of Cours 3 S Kinase

Insulin: two binding sites Of Cours 3

InsulinR α subunit SNI INS Of Cours 3

b a Insulin INSULIN RECEPTOR Of Cours 3

b a Insulin INSULIN RECEPTOR Of Cours 3

INSULIN RECEPTOR a a Insulin b b a a b a b a b b Of Cours 3

Dose-effet [Physiologiques] -10 -9 - 8 -7 -6 -5 [Insuline] (log M) -10 -9 - 8 -7 -6 -5 Of Cours 3 [Insuline] (log M)

Insulin Receptor Signaling Effects on gene expression SH2 Insulin S PH Proline rich PTB PP Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 Y IRS-1/2 pY PH Y699 STAT 5B RAF SOS PP GRB2 RAS PI3K MEK1/2 STAT 5 pY699 pY699 STAT 5 p27KIP ERK1/2 BAD STAT 5B pathway PDK PKB mTOR aPKC Caspase 9 p70S6K GSK3β IKK STAT 5 pY699 AP-1 pY699 STAT 5 CRE FOXO1 TCF NFκB Of Cours 3

Conclusion 2 états du R insuline: Au repos, en l’absence d’insuline: hélices TM mal placées donc TyrKinase inactive, En présence d’insuline: Tyr kinase active, autophosphorylation, recrutement de protéines de signalisation. Liaison: Possibilité de liaison simultanée de 2 insulines/R. Coopérativité négative entre les deux sites de liaison. Of Cours 3