Etudes de toxicité

Plusieurs niveaux d'organisation… Organismes entiers Cellules en culture Organelles ou fonction Photosynthèse (chloroplastes) Protéines Cytochrome P450 (organique) Métallothionéine (inorganique) Acétylcholine estérase (cible moléculaire des insecticides organophosphorés)

Chez divers types d'organismes Invertébrés=> eau douce ou salée Daphnia magna (microcustacés, puces d'eau) Poissons => eau douce ou salée Amphibiens (grenouilles…) Vers de terre => sol Caenorhabditis elegans Protozoaires et petits métazoaires Bactéries Sentinelles Test en labo

Plusieurs types de réponses Certaines protéines spécifiques Métallothionénine (Cd, Pb...) P450 (organiques) Monooxygénases (organiques)

Plusieurs types de stress Choc thermique … modèle et précurseur Plus vieille réponse de stress des êtres vivants Homéostasie des protéines Chaperones Assemblage Trafic transmembranaire et sécrétion

Choc thermique Nombreuses protéines Hsp 27: Hsp32: Heme oxygénase 1 (HO1)

Choc thermique Caractéristiques Thermotolérance Régulation par HSF Protéines communes à de nombreux autres stress: Stress oxydatif, mauvais repliment, stress toxique

Stress oxydatif Déséquilibre entre formation de dérivés réactifs de l'oxygène et le métabolisme protecteur DRO (dérivés réactifs de l'oxygène - ROS) Réduction partielle (un e-) de O sous-produits (indésirables) du métabolisme normal ou de défense Cause du vieillissement ?

Sources des ROS Principale source cellulaire: chaine respiratoire Complexe IV qui réduit O2 en H2O Cycle Q (quinone): •Q + O2 -> •O2 -> •OH- Niveau basal de ROS durant fonctionnement normal Amplifié par anoxie ou hypoxie Poisons mitochondriaux Peroxysomes Radiations ionisantes

Sources des ROS Métabolisme: xanthine oxydase, cyt P450 Réactions spécifiques: Rn de Fenton Phagocytes (•O2-), oxide nitrique (•NO), peroxynitrite (OONO-) Agents exogènes (H2O2) Pathologies? (causes ou conséquences)

Stress oxydatif: dommages cellulaires Lipides insaturés des membranes => perte de propriétés Protéines => dénaturation ADN => mutations => Associé à pathologies: cancer, Alzheimer, asthme, ischémie, déficits fonctionnels liés au vieillissement, diabète, etc……..

DRO (dérivés réactifs de l'oxygène - ROS) Stress oxydatif: DRO DRO (dérivés réactifs de l'oxygène - ROS) H2O2, ROOH, O2•-, OH•-, ONOO-, ? Produits très réactifs (OH•-) Diffusant loin de leur point de formation (H2O2) Formant des radicaux libres capables d'amorcer/propager des réactions en chaîne (O2•-)

Principaux ROS •O2- : anion superoxide - réactif - chaine respiratoire ou auto-oxydation de O2 H2O2: peroxyde d'H - réactif - dismutation O2- - soluble dans membranes •OH-: radical hydroxyle - très réactif - Rn Fenton HOCl: acide hypochloreux -très réactif: acides aminés, thiol - soluble dans membranes Autres: hydroperoxydes organiques (ROOH), oxyde nitrique (•NO), peroxyde nitrique (OONO-)

Roles catalytiques des métaux Fe, Cu, Cr, Va, Co Réaction de Fenton Fe2+ + H2O2 ===> Fe3+ + OH• + OH- Fe2+ + H2O2 ===> Fe3+ + HOO• + H+ => Formation de radicaux libres potentiellement dangereux Réaction de Haber-Weiss Quinones

Stress oxydatif: systèmes protecteurs Antioxydants endogènes ou alimentaires => Désactivateurs ("scavengers" intra- ou extracellulaires) Vitamine C (ascorbate), vitamine E, polyphénols, Méthionine et autres échangeurs thiol-disulfures… Systèmes Catalase-SOD Diverses peroxydases Glutathion Principal agent de maintien des conditions réductrices du cytoplasme Peroxydase (échange thiol-disulfure) (GSHPx)

Stress oxydatif: glutathion Principal agent de maintien des conditions réductrices du cytoplasme Peroxydase (échange thiol-disulfure) (GSHPx)

Stress oxydatif: glutathion Glutathion: tripeptide oscillant entre formes oxydées (GSSG) et réduites (GSH) Élimination de molécules oxydantes: H2O2 Regénéré par réduction en GSH avec NADPH + H+ Cytoplasme: GSH:GSSG = 50:1

Stress oxydatif: glutathion Glutathion peroxydase 2 GSH + A ----> GSSG + AH2 2 GSH + H2O2 ==> GSSG + 2 H2O Élimination du H2O2 + ac. gras peroxydés Glutathion réductase GSSG + NADPH + H+ -----> 2 GSH Régénération du GSH NADPH: produit par voie des pentoses (cyto) transfert du NADH (mito)

Stress oxydatif: superoxyde dismutase SOD 2 O2- + 2 H+ ---> H2O2 + O2 Cofacteur métallique: Zn2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+ Tetrahymena: 1 Mn/Fe et 1 Cu/Zn formula

Stress oxydatif: catalase 2 H2O2 ==> 2 H2O + O2 H2O2 seulement provenant SOD ou autre formula

Réponse aux protéines dépliées UPR (unfolded protein response) Stress du réticulum endoplasmique Elimination des protéines mal repliées ou dénaturées Réticulum endoplasmique et mitochondries Protéines chaperon de type GRP Induites par absence de glucose Blocage/ralentissement de la production de protéines "normales"

Réponse aux protéines dépliées 2 types de mécanismes Levures Cellules mammaliennes => réponse des autres types cellulaires ????? Plantes Protozoaires algues

Autres stress Choc osmotique Hypthermie Radiations Bris mécaniques

Applications Sentinelles Détection de toxiques QSAR Test de toxicité Sur le terrain Au labo

Heme ----(HO)----> Biliverdine + Fe2+ + CO Heme oxygénase • Heme ----(HO)----> Biliverdine + Fe2+ + CO 3 types HO I : inductible (réponse à certains stress) 32 kDa = HSP32 HO 2 : constitutive 36 kDa HO 3: cerveau (?) ==> gènes différents (pas isoformes)

Heme oxygenase I Induction • Induite par nombreux stress dans toutes cell. étudiées Choc thermique Toxiques organiques ou inorganiques Autres stress (radiations UV, ) Sauf hypothermie

Heme ----(HO)----> Biliverdine + Fe2+ + CO Hème oxygénase • Heme ----(HO)----> Biliverdine + Fe2+ + CO Requiert aussi O2 et NADPH Hème = pro-oxydant à éliminer NADP+ doit être recyclé en NADPH + H+ Biliverdine = antioxydant Transformé en bilirubine (puissant anti-oxydant) Fe2+ = agent pro-oxydant Rn de Fenton (si H2O2) Doit être éliminé ou stocké (ferritine) CO Messager local (relié à NO)

Heme oxygenase I Réaction catalysée • Heme + 3 O2 + 3 NADPH + 3 H+ --> Biliverdine + Fe2+ + CO + 3 H2O + 3 NADP+ HO travaille de concert avec P450 et une réductase Biliverdine --> bilirubine

Heme oxygénase

Heme oxygenase •

Nomenclature • H2O2 peroxyde d'hydrogène O2•- superoxide OH•- radical hydroxyde ONOO- peroxyde nitrique

Réaction de Fenton Fe2+ + H2O2 ===> Fe3+ + OH• + OH- Fe2+ + H2O2 ===> Fe3+ + HOO• + H+ => Formation de radicaux libres potentiellement dangereux

Apoptose Destruction cellulaire Nécrose Autophagie apoptose