Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 : Anticorps monoclonaux Université Paris-Sud 11 Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 : Anticorps monoclonaux Ophélie JOLY Marie GUILBAUD Guillaume LEGRAND Clément GAND Année 2013/2014 L3S6 parcours Biologie Santé

PLAN Introduction Etape d’immunisation Coopérations cellulaires mises en place après immunisation Etape de fusion ou obtention des hybridomes Etape de sélection Etapes de criblage et de clonage des hybridomes Comparaison anticorps monoclonaux et polyclonaux Techniques développées à partir des anticorps

Les anticorps Introduction Anticorps = Protéine utilisée par le système immunitaire en réaction à l’introduction d’un pathogène dans l’organisme. Sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Epitope Ag Epitope (déterminant antigénique) = Molécule pouvant être reconnue par un paratope, partie variable d'un anticorps Paratope Paratope = Partie de l'anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l'antigène.

Anticorps avant immunisation Question 1 Anticorps avant immunisation L’immunisation Animal non immunisé IgM IgG IgA produits lors de contacts avec d’autres Ag que la protéine purifiée Titre Ac Jours Semaines Mois

Anticorps après immunisation Question 1 Anticorps après immunisation L’immunisation Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée Après 1ère injection (réaction primaire) Sélection LB Prolifération LB Deviennent effecteurs ou LB mémoires IgG IgM Présence d’IgM puis d’IgG Production d’Ac anti-protéine

Anticorps après immunisation Question 1 Anticorps après immunisation L’immunisation Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée Après 2nde injection (réaction secondaire) LB mémoire activé plus rapidement Réponse + importante, + rapide, + spécifique Après nème injection IgG IgM IgG IgM Production d’Ac anti-protéine: + grande quantité, de meilleure qualité

Haptène et anticorps monoclonaux Question 2 Haptène et anticorps monoclonaux L’immunisation Haptène = Antigène non immunogène, trop petite pour générer une réponse immunitaire seule Exemple d’haptène : DiNitroPhénol = DNP Induction d’une réponse immunitaire par conjugaison avec une molécule transporteuse (BSA, OVA, ..) : Doit être soluble Doit être un corps étranger à l’animal Doit avoir un temps de ½ vie suffisamment long

Réponse anticorps anti-DNP Question 5 Réponse anticorps anti-DNP Coopérations cellulaires Association haptène-protéine porteuse rend immunogène le DNP Production d’anticorps anti-DNP

Anticorps monoclonaux Question 3 Anticorps monoclonaux L’immunisation Immunisation de l’animal avec l’Ag contre lequel on veut un Ac monoclonal Pour la production d’Ac spécifique de l’Ag utilisé Réponse immunitaire adaptative Production Ac en plus grande quantité Production Ac de meilleure qualité et plus affin

Système immunitaire et administration de l’antigène Question 4 Système immunitaire et administration de l’antigène L’immunisation Lieu d’administration de l’Ag important Quand administration dans la voie systémique (SC, ID, IM ..) Circulation vers les Organes Lymphoides Secondaires Contact rapide avec les cellules du Système Immunitaire

Cellules B et réponse anticorps anti-DNP Question 6 Cellules B et réponse anticorps anti-DNP Obtention des hybridomes Plasmocyte = LB différencié capable de produire des anticorps. Myélome = Cancer hématologique (se développe à partir de cellules hématopoïétiques) de la moelle osseuse caractérisée par une prolifération des lymphocytes B.

Fusion et cellules spléniques Questions 7/8 Fusion et cellules spléniques Obtention des hybridomes Cellules spléniques = Cellules de la rate Capacité de production des Ac spécifiques de l’Ag utilisé pour immuniser le donneur Cellules myélomateuses = Cellules cancéreuses Croissance illimitée

Technique des hybridomes Question 6 Technique des hybridomes Obtention des hybridomes Immunisation contre l’Ag Fusion cellules spléniques/myélomateuses Sélection sur milieu spécifique Sélection des hybridomes fabriquant l’Ac anti-Ag Clonage de l’hybridome sélectionné Obtention d’hybridomes : Clones immortels synthétisant l’Ac monoclonal recherché

Milieu de sélection d’hybridomes : HAT Question 11 Milieu de sélection d’hybridomes : HAT Sélection HGPRT : Hypoxanthine-Guanine PhosphoRibosylTransférase Enzyme permettant synthèse de nucléotides par voie de récupération Cellules spléniques : HGPRT+ Cellules myélomateuses : HGPRT- HAT : Hypoxantine Aminopterine Thymidine Aminoptérine : Inhibe synthèse de novo de nucléotides Sélection des hybridomes

Fusion et tissus lymphoïdes Question 8 Fusion et tissus lymphoïdes Obtention des hybridomes Tissu lymphoïde pouvant être utilisé pour la fusion : Les ganglions lymphatiques Les MALT (Tissus Lymphoides Associés aux Muqueuses) Dans organes lymphoïdes secondaires : Présence de LB Lieu de rencontre LB/Ag Lieu d’activation des LB Lieu de production Ac anti-Ag

Hyperimmunisation Obtention des hybridomes Question 10 Hyperimmunisation Obtention des hybridomes Hyperimmunisation = Injection de doses croissantes d’Ag But : Obtention d’une concentration importante de plasmocytes et donc d’Ac spécifique de l’Ag d’intérêt Taux d’Ac (UI/mL) Evolution de la quantité d’Ac selon le nombre d’injections

Caractéristiques des myélomes Question 12 Caractéristiques des myélomes Sélection Cellules myélomateuses utilisées: Immortelles Incapables de secréter Ac HGPRT- : Incapables de synthétiser nucléotides par voie de récupération

Sélection des hybridomes/anticorps anti-DNP Question 13 Sélection des hybridomes/anticorps anti-DNP Criblage et clonage But : Sélectionner les hybridomes produisant des Ac anti-DNP Dosages de liaison Ac/Ag RIA/ELISA Marquage fluorescent de l’Ac Immunofluorescence (Immunohistochimie/Immunocytochimie) Cytométrie de flux Essai de cytotoxicité : Evaluation de la viabilité des Ag après mise en contact avec les lymphocytes.

Clonage de l’hybridome Question 14 Clonage de l’hybridome Criblage et clonage But : Sélection d’un clone produisant un seul type d’anticorps Clonage par dilution limite Principe Dilution du mélange d’hybridomes (1 cellule/puit) 1ère série de dilution : Sélection des cellules sécrétant l’Ac en quantité 2ème série : Vérification de la pureté de la lignée cellulaire 3ème série : 2ème Vérification du clonage Obtention d’un sérum monoclonal

Sérum polyclonal Ac monoclonaux Ac Polyclonaux Question 15 Sérum polyclonal Ac monoclonaux Ac Polyclonaux Sérum = Liquide provenant du sang coagulé et centrifugé, contient des Ac polyclonaux Antisérum = Sérum prélevé chez un individu/animal immunisé. Contient des Ac polyclonaux spécifiques de l’Ag administré

Avantages des anticorps polyclonaux/monoclonaux Question 16 Avantages des anticorps polyclonaux/monoclonaux Ac monoclonaux Ac Polyclonaux Anticorps monoclonal Spécificité : Ac dirigé vers un seul épitope de l’Ag Affinité : Ac très affin Production en grande quantité Constance de ces Ac Production longue et couteuse Anticorps polyclonal Diversité : Reconnaissance d’un Ag sur différents épitopes Différents Ac peuvent fixer un même Ag Fixation moins « critique » Anticorps polyclonaux, liaison à des épitopes différents Anticorps monoclonaux, liaison à un épitope spécifique

Techniques utilisant des anticorps Question 17 Techniques utilisant des anticorps Techniques En diagnostic : Immunoblot Immunofluorescence Agglutination et hémagglutination Réaction de fixation du complément Immunochromatographie Immunoprécipitation Cytométrie de flux Radio-Immuno-Assays (RIA) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) En thérapeutique : Immunothérapie

Diagnostic Techniques Immunoblot (Cas du VIH) Question 17 Diagnostic Techniques Immunoblot (Cas du VIH) Dissociation par un détergent du pathogène Séparation des protéines constitutives du pathogène par SDS PAGE Transfert sur membrane de nitrocellulose et incubation avec un antiserum (contenant Ac polyclonaux anti-VIH) Détection des Ac fixés aux Ag par un Ac secondaire couplé à une enzyme Mise en évidence des anticorps dirigés contre le pathogène dans le sérum des patients infectés

Diagnostic Techniques Immunofluorescence Question 17 Diagnostic Techniques Immunofluorescence 1er marquage : Fixation de l’Ac monoclonal primaire sur l’Ag 2ème marquage : Fixation de l’Ac polyclonal secondaire sur l’Ac primaire. L’Ac secondaire est couplé à un fluorochrome Détection du complexe Ac/Ag au microscope électronique à fluorescence Recherche d’un pathogène

Diagnostic Techniques Hemagglutination Question 17 Diagnostic Techniques Hemagglutination (Détermination du groupe sanguin) Prélèvement sanguin d’un patient Mise en contact Ac/GR Agglutination : Ac reconnait la structure antigénique portée par le GR. Pas agglutination : Ac ne reconnait pas la structure antigenique portée par le GR.

Diagnostic Techniques Réaction de fixation du complément Question 17 Diagnostic Techniques Réaction de fixation du complément Ajout dans le sérum de l’Ag et du complément Si présence de l’Ac anti-Ag dans le sérum, fixation Ac/Ag/Complément Ajout de GR et d’Ac anti-GR Si le complément est fixé avec le complexe Ac/Ag, ne peut se fixer au complexe GR/Ac anti-GR : Absence d’hémolyse Test positif Si le complément n’est pas fixé au complexe Ac/Ag (car absence d’Ac), se fixe au complexe GR/Ac anti-GR : Hémolyse Test négatif

Diagnostic Techniques Immunochromatographie (Cas du test de grossesse) Question 17 Diagnostic Techniques Immunochromatographie (Cas du test de grossesse) En cas de grossesse, il y a production d’hCG retrouvé dans le sang et l’urine Fixation de l’hormone sur l’Ac anti-hCG Migration du complexe Ac/Ag jusqu’à reconnaissance de l’Ag par un 2ème Ac spécifique : Arrêt de la migration dans la zone test Utilisations possibles pour la détection : VIH, Paludisme, Peste, Cholera, ..

Diagnostic Techniques Immunoprécipitation Question 17 Diagnostic Techniques Immunoprécipitation Marquage des cellules par un acide aminé radioactif Lyse des cellules par un détergent : Obtention Ag + Débris cellulaires Ajout d’Ac monoclonaux fixées sur des billes Lavage : Elimination des Ag non fixées pas un Ac et des débris cellulaires Séparation des Ag par SDS PAGE : Migration des Ag selon la taille Marquage métabolique Marquage protéines Marquage des cellules Lyse Ajout d’Ac fixées Lavage Séparation sur des billes SDS-PAGE

Diagnostic Question 17 Techniques Technique du phage display

Thérapeutique Techniques Immunothérapie Question 17 Thérapeutique Techniques Immunothérapie But : Cibler spécifiquement les cellules tumorales en adressant un Ac monoclonal modifié. (1) (2) Utilisation d’Ac monoclonaux modifiés couplés: (3) à une toxine bactérienne ou végétale (1) à un isotope radioactif (2) à un enzyme capable d’activer des prodrogues (3) Ac = Vecteur d’acheminement des substances vers les cellules tumorales Différentes actions possibles : - Bloque signal de survie - Bloque signal de prolifération - Induit l’apoptose

Les perspectives de demain … Aujourd’hui : 28 anticorps monoclonaux à la disposition des patients (le 1er a été mis sur le marché en 1986) 250 anticorps monoclonaux en développement Quel avenir pour l’immunothérapie ? Anticorps monoclonaux : vers traitement pour toutes les pathologies ? IgA : un anticorps plus efficace et plus localisé que IgG ?

Merci de votre attention !!