Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie 1

PLAN Survol historique Considérations toxicologiques Approches en immunotoxicologie Conckusions 2

SURVOL HISTORIQUE 1884 La phagocytose 1890 Les anticorps 1901 Les groupes sanguins 1950-60 Les bases cellulaires de l’immunité 1970-80 Les bases moléculaires de l’immunité 1975 L’immunopharmacologie 1980 L’immunotoxicologie · cibles (1983) · résistance (1985) 3

Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique Prolifération lymphoblastique Présentation de l’Ag Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Sécrétion d’anticorps Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B Th NK Je revenir sur l’organisation générale de la réponse immunitaire afin de situer en quelque sorte les fonctions les plus utilisées en tant que biomarqueurs d’immunotoxicité. La réponse immunitaire non-spécifique comprend comme je vous l’ai mentionné: l’activité cytotoxique des cellules NK qui vont reconnaître et détruire les cellules infectées ou les cellules néplastiques, ce en dehors de toute reconnaisance préalable par les acteurs de l’immunité spécifique

Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique Phagocytose Réactions inflammatoires Présentation de l’Ag B Réponse immunitaire humorale B Activité cytotoxique Tc NK Th Réponse immunitaire cellulaire Th Tc B Prolifération lymphoblastique Importance de regarder au travers de plusieurs fenêtres du SI car phénomène de compensation Y Sécrétion d’anticorps Phénotypage

ASPECTS RÉGLEMENTAIRES Santé humaine ? Santé des écosystèmes ? CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES 4

CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES 1. Fiabilité et reproductibilité des méthodes 2. Sensibilité des paramètres sélectionnés 3. Allure de la courbe dose-réponse 5

1. FIABILITÉ ET REPRODUCTIBILITÉ DES MÉTHODES 6

PROGRAMME INTERNATIONAL D ’HARMONISATION PROTOCOLE 10 laboratoires d ’Europe et des États-Unis Rat Réponse humorale par la technique des plages de lyse (PFC) Azathioprine composé modèle Résultats exprimés en pourcentage de la réponse du laboratoire de référence 7

Y Réponse immunitaire non-spécifique Réponse immunitaire spécifique Prolifération lymphoblastique Présentation de l’Ag Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Sécrétion d’anticorps Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B Th NK Je revenir sur l’organisation générale de la réponse immunitaire afin de situer en quelque sorte les fonctions les plus utilisées en tant que biomarqueurs d’immunotoxicité. La réponse immunitaire non-spécifique comprend comme je vous l’ai mentionné: l’activité cytotoxique des cellules NK qui vont reconnaître et détruire les cellules infectées ou les cellules néplastiques, ce en dehors de toute reconnaisance préalable par les acteurs de l’immunité spécifique

PRINCIPE DES PFC Complément GRM Splénocytes Chambre de Cunningham 8

PROGRAMME INTERNATIONAL D’HARMONISATION (Réponse humorale) 500 450 400 350 300 % LAB. RÉFÉRENCE 250 Dose 1 200 Dose 2 150 Dose 3 100 50 Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab Lab 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 9

2. SENSIBILITÉ DES PARAMÈTRES SÉLECTIONNÉS 18

EFFET DES MÉTAUX LOURDS SUR LA PHAGOCYTOSE DES COELOMOCYTES CHEZ LE VER DE TERRE 35000 CdCl2 CdCl2 ZnCl2 30000 CH3HgCl HgCl2 25000 20000 Index de phagocytose 15000 10000 5000 1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4 Concentrations (M) 21

ANALYSE DES RÉSULTATS CI 50 DOSE % réponse normale 50 100 150 10 20 30 50 100 150 10 20 30 40 60 70 80 90 % réponse normale 22

IMMUNOTOXICITÉ COMPARATIVE DES MÉTAUX CHEZ LE VER DE TERRE (CI 50) ZnCl2 CdCl2 HgCl2 CH3HgCl > 10 x 10-5 M 3.0 x 10-5 M 1.8 x 10-5 M 0.03 x 10-5 M 23

3. ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE 26

ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE 1: NOEL; 2: dose de référence; 3:dose 50 % ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE Effet Adulte 2 1 3

ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE Effet Adulte Embryon 1 2 3 4 1: NOEL embryon; 2: dose de référence; 3: NOEL adulte; 4: dose 50% ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

PROTOCOLE NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRIN 1, 4, 7, 10, 14, 28, 42 DAYS TESTS IMMUNOLOGIQUES MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES

EFFETS DE LA DIELDRINE SUR LES CELLULES PRODUCTRICES D ’ANTICORPS % Réponse normale 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2 Dose (LD50)

IMMUNOTOXICITÉ DE LA DIELDRINE MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES PHAGOCYTOSE FLAMBÉE OXIDATIVE PROCESSING DE L ’ANTIGÈNE PFC LPS Ab CON A PHA MLR GVH

PROTOCOLE MODÈLE DE RESISTANCE NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRINE MURINE HEPATITIS VIRUS 3 Salmonella typhimurium

RESISTANCE AUX INFECTIONS ANTI BACTERIENNE ANTI VIRALE S. typhymurium MHV 3 MORTALITÉ BACTÉRICIDIE PHAGOCYTOSE ANTICORPS MORTALITÉ ANTICORPS EFFETS CYTOPATIQUES RÉPLICATION

TOXIQUES BPC congenères 138, 153, 168, 180 Chlorure de mercure Chlorure de méthyl mercure Benzo-a-pyrene Chloride de cadmium Chlorure de zinc TCDD DDT, DDE Mélanges (synthétiues, effluents, sédiments) insecticides herbicides

RELATIONS TOXIQUE ET SYSTÈME IMMUNITAIRE AUTOIMMUNITÉ SOI MODIFIÉ SOI SUSCEPTIBILITÉ AUGMENTÉE * INFECTIONS * CANCERS IMMUNOSUPPRESSION SYSTÈME IMMUNITAIRE ALLERGIES ELIMINATION RÉPONSE IMMUNITAIRE ANTI-X NON-SOI

IMMUNO COMPÉTENCE? CANCERS INFECTIONS CONTAMINANTS

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 40

LISTE DES ESPÈCES Mye Moule Mactre Choquemort Plie Truite Chien Chat Poulet Aigle Caille Écureuil Rat Souris Ver de terre Phoque Béluga Ours polaire Cochon Bœuf Bœuf musqué Lama Élan Cheval Chèvre Mouton Alligator Grenouille 27

SENSIBILITÉ DES ESPÈCES HgCl2 CI50 (x 10-5) Choquemort 0.08 Truite 0.13 Mye 0.48 Bœuf musqué 1.09 Bœuf 1.24 Lama 1.29 Aigle 1.40 Élan 1.43 Mouton 1.70 Ver de terre 1.80 Poulet 1.90 Cochon 10.08 Rat 10.20 Humain 100.03 28

Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) 20 40 60 80 100 120 140 10 - 9 8 7 6 5 4 CH 3 HgCl 2 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) 20 40 60 80 100 120 140 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 CH3HgCl HgCl2 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) 20 40 60 80 100 120 140 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 CH3HgCl HgCl2

PCB 138 PCB 180 PCB 156 PCB 153 * % proliferation concentration (ppm) IC =89ppm 50 IC =44ppm IC =67ppm IC =73ppm * 25 75 100 10

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE ZnCl 2 10 ug/l 50 ug/l CdCl 1 ug/l 5 ug/l Hg/Zn 0,3/30 ug/l 0,5/50 ug/l Cd/Zn 3/30 ug/l 5/50 ug/l CH 3 HgCl 0,1 ug/l 0,5 ug/l UN METAL Cd/Hg 3/0,3 ug/l 5/0,5 ug/l DEUX METAUX Cd/Hg/Zn 3/0,3/30 ug/l 5/0,5/50 ug/l TROIS METAUX Truite arc-en-ciel 30 jours d ’exposition

PARAMÈTRES Rein oxidative burst phagocytose macrophage PHA LPS ConA cytométrie phagocytose macrophage PHA LPS ConA prolifération H 3 -thymidine lymphocyte lysozyme activité colorimétrie IgM ELISA serum Rein

CHLORURE DE CADMIUM % réponse du témoin -80 80 -100 -60 -40 -20 20 40 80 -100 -60 -40 -20 20 40 60 100 120 * * * 1ug/l * * * * * * * * * * * 5 ug/l % réponse du témoin Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM

CHLORURE DE MERCURE % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 20 40 60 80 100 120 140 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoin 0.1 ug/l 0.5 ug/l * * *

CHLORURE DE ZINC % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 20 40 60 80 100 120 140 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoin 10 ug/l 50 ug/l * * *

CADMIUM / MERCURE % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 20 40 60 80 100 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 3/ 0.3 ug/l 5/ 0.5 ug/l * *

CADMIUM / ZINC % réponse du témoinl 100 -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 20 40 60 80 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM % réponse du témoinl 3/30 ug/l 5/50 ug/l * *

MERCURE / ZINC % réponse du témoin -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 20 40 60 80 Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 0.3/30 ug/l 0.5/50 ug/l * * *

CADMIUM / MERCURE / ZINC -100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80 100 120 140 % réponse du témoin Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM 3/0.3/ 30 ug/l 5/0.5 /50 ug/l * * * nd

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

Facteurs confondants Nombre d’individus Âges Sexe Sites

Nombre % Variation 25 50 75 3 9 12 6 18 Nombre d’individus

SITE % phagocytes/rein 5 10 15 Ma Me Hu Lac

Variations mensuelles % Phagocytes/rein 5 10 15 Juil Sept Oct Mois

Variations liées au sexe % Phagocytes/rein 15 10 M M F 5 F F M Ma Me Hu Lac

SENSIBILITÉ AU MERCURE 40 60 80 100 20 -9,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -3,0 Concentration (M) % Réponse Normale

Transformation blastique 5 10 20 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 Apopka Woodruff Con A ug cpm x 1000 Transformation blastique 2

Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) 1 2 3 4 5 6 Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) A B BC C Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en juillet

Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en septembre 1 2 3 4 5 6 Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 ) A B BC C

APPROCHES MODÈLES CLASSIQUES IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON 40

BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais * : μg/g sédiment sec   BPC* 1 2 3 3,3’,4,4’- T4CB 5700 740 86 2,3,4,3’4’- P5CB 29000 3030 280 2,4,5,3’,4’- P5CB 53000 4460 411 3,3’,4,4’,5- P5CB 230 20 2,3 3,3’,4,4’,5- H6CB 3,2 0,5 0,1 BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

Métaux dans les sédiments de la Baie-des-Anglais   Métaux* 1 2 3 Pb 23,65 18,63 16,75 Cd 0,20 0,09 0,06 Ag 0,07 0,04 - Cu 18,90 18,03 9,12 Hg 0,08 0,03 0,01 * : μg/g sédiment sec Métaux dans les sédiments de la Baie-des-Anglais Sites

HAP dans les sédiments de la Baie-des-Anglais Produits de combustion (μg/g sédiment sec) 50 25 1 2 3 Sites

Protocole expérimental Site 1, 2, 3 Site 1 1 3 semaines Protocole expérimental

Protocole expérimental

Effets de l ’exposition in situ 5 10 15 20 25 30 35 40 Cells MO 1+ MO 3+ Nombre de cellules (107) Site 3 Site 2 Site 1

Protocole expérimental Site 1 sédiment Sable 1, 2, 3 mois et recouvrement immunologie, analyse chimique

Nombre de macrophages actifs 1 2 3 4 5 6 7 1 mois 2 mois 3 mois Récupération Nombre de cellules (107) Témoin Exposé

Pathologies Neoplasies 15 17.6% Pneumonies (vers) 15 17.6% Infections bactériennes 13 15.3% Malformations 5 5.9% Parasitisme 4 4.7% Infections (virus, autres) 6 7.1% Non déterminées 18 21.1% Autres causes 9 10.5% 85 nécropsies de 235 carcasses (1982-97)

Tumeurs décrites Adenocarcinomes: intestin, estomac, utérus, glandes salivaires, glandes mammaires Carcinome de la vessie Lymphosarcome thymique Tumeurs de l’ovaire (granulosa, dysgerminoma) Hépatocarcinome

Programme de recherche Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

Lymphocytes de bélugas et DDE

Lymphocytes de bélugas et DDT

Expositions in vitro Métaux : Pb, Cd, Hg, Ag, Zn, Cu TCDD, DDT, DDE Congénères de BPC Insecticides, herbicides Mélanges

Programme de recherche Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

Protocole expérimental Diète pour 90 jours - Gras de bœuf - Huile de maïs - 100 % béluga Saint-Laurent ou Arviat - mélange 75:25, 50:50, 25:75 Compétence immunitaire Phagocytose, transformation blastique, phénotypage, NK, PFC Protocole expérimental

20 40 60 80 100 120 140 160 Boeuf 75/25 25/75 100 St % N.R. * PFC Maïs 50/50

Sexe et maturation Hémolymphe Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE2, PgF2 Phagocytose

Time (h) Fluorescence FL1 (% cells) 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 5 10 15 20 25 Fluorescence FL1 (% cells) 30 40 50 60 70 Mya truncata Siliqua costata Mesodesma arctatum Serripes groenlandicus Cyrtodaria siliqua Elliptio Complanata (Azide)

EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO 50 100 150 200 250 300 1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4 1x10-3 CONCENTRATIONS ( M ) EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO CH3HgCl HgCl2 CdCl2 ZnCl2 AgNO3 Brousseau et et al., 2000. Toxicology 142 : 145-156.

PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS CMFDA CMF Conjugaison des thiols Non conjugué Esterase DA CMF-SH PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS

Effet de la NEM sur la fluorescence induite par la CMFDA 1200 1000 800 Fluorescence moyenne 600 400 200 10 20 40 80 100 Dose de NEM (ug/ml)

EFFET DU MERCURE SUR LE NIVEAU INTRACELLULAIRE DE THIOLS CHEZ LA MYE Concentrations (M) Intensité de fluorescence (FL1) 50 100 150 200 250 300 350 400 450 10-8 10-4

Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE2, PgF2 Sexe et maturation Phagocytose 5

Protocole expérimental Témoin N = 15 0.1 X [TBT] = 5 µg.L-1 [Atrazine] = 8 µg.L-1 [Diuron] = 0.07 µg.L-1 [E2] = 10-10 M X [TBT] = 50 µg.L-1 [Atrazine] = 80 µg.L-1 [Diuron] = 0.7 µg.L-1 10 X [TBT] = 500 µg.L-1 [Atrazine] = 800 µg.L-1 [Diuron] = 7 µg.L-1 [E2] = 10-8 M

Expositions In vivo Eau de mer 200 ml/min. Contaminants 0.2 ml/min. débimètre Contaminants 0.2 ml/min. Eau de mer 200 ml/min. Mytilus edulis Filtre Mya arenaria Expositions In vivo

PROTOCOLE - In Vivo HgCl2 CH3HgCl 10-9M 10-8M 10-7M 10-6M 10-5M FILTRE

Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.) -9 -6 200 100 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.) 300 -7 -8 Dose Molaire CH3HgCL HgCl2

100 200 50 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre la charge tissulaire et l ’inhibition de la phagocytose Phagocytose %

Blanc Sablon - Havre - St - Pierre Gaspé Carleton Grande Rivière - Havre - aux - Maisons

% de phagocytose moules Grande-Rivière transplantées en fonction du temps (2002) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Juin Juillet Août Sept. Octo. Nov. Mois % de phagocytose 1 bille 3 billes et +

CONCLUSIONS 1. Xénobiotiques SI Espèces labo. Expositions contrôlées In vitro Espèces labo. Expositions contrôlées (résistance) In vivo In vitro Espèces fauniques Expositions contrôlées In vivo Espèces fauniques Terrain In vivo 46

Mécanismes d ’immunotoxicité CONCLUSIONS 2. Mécanismes d ’immunotoxicité Laboratoire Terrain 47

Biomarqueurs immunologiques en écotoxicologie CONCLUSIONS 3. Biomarqueurs immunologiques en écotoxicologie Utilisation Suivi environnemental d ’espèces fauniques Validation Espèces laboratoire Espèces fauniques 48

Biomarqueurs immunologiques en CONCLUSIONS 4. Biomarqueurs immunologiques en santé humaine Validation Etude clinique Utilisation Suivi environnemental 49

Altérations physiologiques Fonctions cellulaires Impact éclogique croissant Écosystème Échelle de temps Communauté Population Santé de l’individu Altérations physiologiques Dépasse le cadre de l’immunotoxicité Un suivi immunologique = suivi de l’état de santé et de la susceptibilité aux maladies (cancers et infectieuses) Mesurer une altération du système immunitaire et les conséquences que cela comporte, que la cause soit la pollution de l’environnement ou une combinaison de facteurs don’t la contamination fait partie. Fonctions cellulaires Réponses moléculaires et cellulaires Exposition

Malades mais vont survivre Ne survivront pas Pathologie légère Présence d’Ab % de population Et ici, je voudrais justement attirer votre attention. On a dit et écrit beaucoup de chose sur le potentiel immunotoxique des contaminants de l’environnement. Il faut garder à l’esprit et c’est valable pour les Cumulatifs (valable en général pour tous les systèmes – Reproducteur) « latents » un organisme « biologiquement » (critères de base des organismes vivants) doit se reproduire. On se reproduit, ou on ne se reproduit pas (la seule intermédiaire = descendance dégénérée). Par contre, pour le système immunitaire, on peut luter plus ou moins efficacement contre des pathogènes plus ou moins dangereux. Résistance au pathogène