Taxonomie bactérienne Ph Riegel Pharmacie

Définitions Taxonomie: science de la délimitation des bactéries en groupes (familles, genres, espèces…). Classification: attribution d’une identité à une bactérie après études taxonomiques et selon des règles appelées nomenclature Identification: assimiler une bactérie à une espèce déterminée en fonction de caractères communs. Phylogénie: science de l’évolution génétique dans le temps d’une bactérie parmi toutes les autres

Nom des bactéries Une bactérie est définie par: Le genre L’espèce 1ère lettre en majuscule L’espèce Pas de majuscule Une bactérie est aussi incluse dans une famille et un ordre (en italique, 1ère lettre en majuscule) Ex: Escherichia coli, famille des Enterobacteriaceae

Méthodologie Classification phénotypique Classification génotypique Tests biochimiques: enzymes, assimilation, fermentation Morphologie (Gram, forme, mobilité) Structure de molécules: chimiotaxonomie (lipides, protéines) Classification génotypique Détermination de groupes génomiques Détermination des filiations (évolution) par études phylogéniques

Classification phénotypique simple Tests biochimiques simples et en nombre réduits (fermentation de sucres, utilisation de composés carbonés, caractères de croissance): très subjectif (pour le choix des tests et leur lecture) peu fiables (une mutation ponctuelle peut survenir).

Classification simple

Classification phénotypique complexe (1) Taxonomie basée sur l’analyse d’un nombre important de caractères biochimiques Plusieurs méthodes: Méthode dite de « pas à pas », chaque caractère engendre une dichotomie dont l’aboutissement rassemble des souches avec tous les caractères communs. Mais risque d’erreur si une mutation Analyse factorielle: chaque souche est positionnée dans un espace 2D des variables en fonction de ses caractères.

Classification numérique

Classification phénotypique, chimiotaxonomie Étude de molécules qui résultent d’une série de réactions enzymatiques et donc de l’expression de plusieurs gènes (contre un seul pour de nombreux tests simples). Paroi: Acides gras, acides aminés, sucres Membrane cellulaire lipides Cellule: protéines

Bactéries Gram négatif

Bactéries gram positif

Paroi Acides gras Chaîne carbonée de 2 à 90 atomes présents dans le LPS (Gram -) ou paroi (Gram +) Résistance à l’alcool et à l’acide pour des longueurs supérieure à 36 C (coloration de Ziehl pour les mycobactéries (60-90 C) ou modifiée pour les Nocardia (36-60 C). Ces acides sont appelés acides mycoliques. Détermination par CPG ou HPLC

Paroi Peptidoglycanne: Polymères formés par des chaînes linéaires de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique, reliées entre elles par de courtes chaînes peptidiques composés d’acides aminés ou diaminés (ac diaminopimélique). Différences entre certains genres bactériens

Membrane Lipides polaires Ils sont présents dans les membranes cellulaires. Détermination par chromatographie (CCM) Différenciations de genres bactériens

Composés cellulaires Protéines cellulaires: Détermination des profils électrophorétiques de l’ensemble des protéines. Possibilité de révéler ensuite certaines protéines particulières (zymogrammes pour les enzymes, Western-Blot pour les antigènes)

Caractéristiques chimiotaxonomiques

Taxonomie génomique Plusieurs approches, souvent complémentaires: Étude du génome complet: G+C % hybridation ADN/ADN total polymorphisme de restriction de l’ADN total Séquençage du génome Étude d’une portion du génome Polymorphisme de restriction d’une portion d’ADN Séquençage de gènes

G+C % de l’ADN Composition en bases de l’ADN varie d’un organisme à l’autre (Chargaff, 1949). G+C % = G + C / G + C + A + T (x 100) Détemination: Densité de l’ADN Température de demi-dénaturation (Tm) Chromatographie des nucléotides après hydrolyse complète de l’ADN: CCM, HPLC, électrophorèse capillaire Variation entre 25 et 75 % entre les espèces, ne doit pas être différent de plus de 3 % à l’intérieur d’une espèce Peu utile, phylogénie grossière: haut G+C %, bas G+C % pour les Gram +

G + C %, HPLC

G + C % valeurs

Hybridations ADN/ADN « gold standard » pour la détermination des espèces. Estimation de la similarité de deux ADN même espèce: > 70 % même genre: 1 à 60% genres différents: < à 5 % Possibilités d’évaluer la solidité des hybrides en mesurant les Tm de chacun des hybrides (homologues et hétérologues)

Hybridations ADN/ADN, principes

Autres techniques génomiques Polymorphisme de restriction de l’ADN. Des enzymes dits de restriction coupent l’ADN en des sites particuliers (de 3 à 6 nucléotides). Il peut s’agir soit de l’ADN total, soit d’un fragment amplifié Electrophorèse soit unidirectionnelle (petit fragment) soit pluridirectionnelle pour les gros fragments (champ pulsé). Des fragments différents reflètent des différence de nombre, de structure et de position de ces sites de restriction le long de l’ADN. Cette technique peut être couplée à l’utilisation de sondes (ex ARN 16S et 23S ribosomiques dit ribotypage), limitant le nombre de bandes à l’électrophorèse

Polymorphisme de restriction Sans sondes Sonde rADN 16S

Polymorphisme de gène Exemple: Polymorphisme de restriction du gène de l’ARN 16S ribosomique (ARDRA) Amplification, action de l’enzyme puis électrophorèse

Séquençage de gènes et phylogénie Utilisation de gènes « universels », c’est-à-dire présents chez toutes les bactéries Gènes essentiels à la vie bactérienne dont les mutations sont rares et reflètent l’évolution lente des bactéries Les plus utilisés: ARN 16S, rpoB, SDO, ATPase La comparaison d’une séquence avec d’autres permet de décrire potentiellement de nouvelles espèces. Cette comparaison permet aussi de placer une espèce (ou une souche) dans l’arbre de l’évolution, pour la définition des genres, familles et ordres.

Séquençage de gène

Séquençage, techniques

Comparaison de séquences Interrogation par l’intermédiaire d’un site Internet ou d’un logiciel: Inclusion de séquences proches (même genre) dans le logiciel Détermination d’une séquence consensus Comparaison avec cette séquence consensus et les autres Modifications possibles en cas de doutes sur quelques bases

Comparaison de séquences, BLAST

Interprétation des séquences Niveau d’homologies des séquences: exprimés en % d’homologie ou en % de divergences. Actuellement, les seuls critères taxonomiques concernent la comparaison des gènes de l’ARN 16S: Plus de 97,5 % d’homologie, même genre mais seulement possibilité de même espèce, faire des hybridations ADN/ADN. Entre 90 et 97,5%: espèces différentes, a priori même genre, à conforter par chimiotaxonomie. Moins de 90%: a priori genres différents Pour les autres gènes: étude phylogénétique études taxonomiques pour des genres dont l’ARN 16S est très similaire

Interprétation en taxonomie moléculaire

Intérêts des méthodes taxonomiques G+C % /PeptG ARN 16S /Lipides RFLP 16S ADN/ADN /protéines RFLP avec +/- sondes Famille ++ +++ - Genre + Espèce Sous-espèce +/-

Construction d’arbres phylogéniques Une fois que les séquences, forcément assez voisines sont alignées, on peut calculer des arbres phylogéniques reflétant les divergences successives au cours de l’évolution. Un arbre phylogénique est caractérisé par sa topologie (sa forme) et la longueurs de ses branches. Calcul de la robustesse des arbres: probabilité de retrouvé chaque nœud de l’arbre pour 100 recherches (bootstrap)

Arbre phylogénique

Stratégie d’identification bactérienne Souche inconnue Séquence ARN 16S, interrogation Internet 98, 5% < 98,5% Identification acceptée pas d’identification (sauf si atypique) nouvelle espèce?

Stratégie taxonomique Taxon connu mais très hétérogène Plusieurs groupes par taxonomie numérique Confirmation par hybridation ADN/ADN Séquence ARN16S des représentants >98,5% < 98,5 % Hybridation entre représentants nouvelles espèces