II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes Jeudi 8 septembre 2005 II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

Généralités Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) Marquage fluorescent des molécules à suivre

Concentrations ioniques Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide Indicateurs sensibles aux ions luminescents (aequorine de la méduse) fluorescents

Aequorine : protéine luminescente en fonction de [Ca++] libre entre 0,5 et 10 M injection d'aequorine puis fécondation photo toutes les 4 secondes Libération de [Ca++] dans le cytoplasme Mais très faible intensité Fig 9-38

Fig 9-39 Cellule de Purkinje Indicateur fluorescent sensible à [Ca++] (fura-2) [Ca++] intra cellulaire en fluorescence rouge : forte [Ca++] (dendrites) bleu : faible [Ca++] Fig 9-39

Autres indicateurs fluorescents Autres ions

Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur Anticorps Protéine cellulaire purifiée marquée Exemple tubuline

Jeudi 8 septembre 2005 Fig 18-21 tubuline P572#2

Fig 16-12 tubuline

Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une fonction Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose

Quatre méthodes d'introduction de molécules dans la cellule Microinjection Électroporation Vésiculation Projection à haute vitesse…

Fig 9-40 (AB)

Fig 9-40 (CD)

Molécules captives Synthèse d'une forme inactive de la molécule Jeudi 8 septembre 2005 Molécules captives Synthèse d'une forme inactive de la molécule Introduction dans la cellule Activation à un temps et moment donné par un faisceau lumineux eg : molécules captives pour Ca++, AMPc, GTP, IP3 P572#3

Fig 9-41 Caged molecules La molécule X devient active après le flash d'UV

Application Molécules fluorescentes piégées Grosse modification de la molécule qui doit rester active  grosse difficulté  Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules eg : tubuline

Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine Après 1,5 mn Après 2,5 mn Tubuline rhodamine (rouge) Dapi ADN (bleu) Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et invisible avant le rayon d'UV)

Jeudi 8 septembre 2005 Desai,A1998

Jeudi 8 septembre 2005

Green Fluorescence Protein

Fig 9-43 GFP

GFP 3D

GFP GFP Topol

GFP mice

Fig 9-44 GFP tagging

Jeudi 8 septembre 2005 GFP An inhibitory neuron in a living slice culture of the neonatal mouse hippocampus, transfected with the gene for Green Fluorescent Protein

Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging

III - Culture cellulaire Isolement Séparation (FACS) Culture primaire et secondaire Milieu de culture Lignée cellulaire Transformation Congélation Clone Hybride

Facs

Hybride cellulaire

Production AC monoclonaux

Culture SEM

Immuno gold en ME ME Immuno-gold

Pistage de molécules dans la cellule Pulse-chase Patch-Clamp Molécules « piégées » Les anticorps immunofluorescence directe immunofluorescence indirecte

Fig 9-46

Fig 9-47 Autoradiographie en microscopie électronique 5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas Fig 9-47 Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse

Fig 9-48

IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules Jeudi 8 septembre 2005 IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules Techniques biochimiques