Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA) Alain A Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA) Alain A. Schweitzer, PhD PCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle GMP, Paris, Février 2004

Sommaire La méthode d’Ullberg Détection de la radioactivité Définitions Historique La méthode d’Ullberg Détection de la radioactivité Quantification des autoradiogrammes Interprétation des résultats Principales applications Conclusions GMP, Paris, Février 2004

Définitions Ensemble de méthodes “photographiques” permettant la détection et la localisation spatiale/géographique d’éléments radioactifs présents dans un échantillon solide Macro- vs. Microautoradiographie QWBAR, QWBAL et DNC GMP, Paris, Février 2004

Historique (autoradiographie) 1897 (Niepce de St Victor): 1er “autoradiogramme” (sels d’uranium) GMP, Paris, Février 2004

Historique (autoradiographie, suite) 1904 (London) : 1ère application biologique de l’autoradiographie GMP, Paris, Février 2004

Historique (autoradiographie, suite) 1953: 1ère utilisation des particules β- (Dziewiatkovski) 1954: WBAR des substances diffusibles (Ullberg) 1963: 1ère tentative de quantification WBAR (Kutzim) 1975: Brévet (USA) des écrans-phosphore (Luckey) 1983: Comptage Nucléaire Direct (Jeavons) 1989: Autoradioluminographie (Miyahara) GMP, Paris, Février 2004

Historique (coupes d‘animaux entiers) 1947 (Libby) : scie à ruban, 2-3 mm, souris 1954 (Ullberg) : microtome, 100 µm, en chambre froide 1959 (Cohen et al.) : microtome à congélation (CO2) 1961 (Pellerin) : rape/fraise d’atelier, seulement 1 WBA 1962 (Martin et al.) : disque abrasif/perceuse, souris 1966 (Kalberer) : scie circulaire, 2-4 mm, chat, singe 1977 (Ullberg) : cryomicrotome, méthode actuelle GMP, Paris, Février 2004

Historique (méthode de Kalberer, 1966) GMP, Paris, Février 2004

Congélation Enrobage “Trimming” Obtention des coupes Cryodessication La méthode d‘Ullberg Congélation Enrobage “Trimming” Obtention des coupes Cryodessication GMP, Paris, Février 2004

Congélation des animaux Azote liquide ?? Hexane-CO2 solide Souris 15-30 min (<pour males and fng <25 g) Rat 30-60 min (<pour males and fng <180 g) Lapin 2-4 h (<pour males and fng <2 kg) Singe 2-4 h (<pour males and fng <1.5 kg) Congélation rapide = pas de diffusion Curtis et al., 1981. Whole-Body Autoradiography. Academic Press, Inc., London) GMP, Paris, Février 2004

Enrobage GMP, Paris, Février 2004

Le Leica CM3600 PLC GMP, Paris, Février 2004

Le Leica CM3600 PLC GMP, Paris, Février 2004

Atteinte du niveau de coupe (“trimming”) GMP, Paris, Février 2004

Obtention des coupes GMP, Paris, Février 2004

La coupe GMP, Paris, Février 2004

Détection de la radioactivité Autoradiographie, à l‘aide de films (QWBAR) Autoradioluminographie/imagerie phosphore, à l‘aide d‘écrans-phosphore (QWBAL) Comptage nucléaire direct, dans le compteur GMP, Paris, Février 2004

QWBA / Principe QWBAR GMP, Paris, Février 2004

QWBA / Principe QWBAL GMP, Paris, Février 2004

QWBAL / exemple de balayage GMP, Paris, Février 2004

QWBAL / exemple de balayage /Cyclone GMP, Paris, Février 2004

QWBAL / exemple de balayage /BAS5000 GMP, Paris, Février 2004

QWBA / principe DNC / MICAD GMP, Paris, Février 2004

QWBA / principe DNC /BetaImager 2000 GMP, Paris, Février 2004

QWBA / comparaison QWBAL et DNC GMP, Paris, Février 2004

QWBA / durées QWBAR, QWBAL et DNC GMP, Paris, Février 2004

QWBA / analyse en temps réel DNC GMP, Paris, Février 2004

QWBA / analyse en temps réel DNC GMP, Paris, Février 2004

QWBA / comparaison QWBAL et DNC GMP, Paris, Février 2004

QWBA : Résolution “film” GMP, Paris, Février 2004

QWBA : Résolution PhosphorImager GMP, Paris, Février 2004

QWBA : Résolution BetaImager (3H, 14C) GMP, Paris, Février 2004

QWBA / DNC (résolution µ-Imager®) GMP, Paris, Février 2004

QWBA : Quantification GMP, Paris, Février 2004

Quantification Historique GMP, Paris, Février 2004

Quantification Historique Kutzim (1963) 1ère quantification des WBA par densitometrie GMP, Paris, Février 2004

Quantification auto-absorption tissulaire ? caractéristiques des coupes ? conditions d‘exposition ? GMP, Paris, Février 2004

Quantification : auto-absorption tissulaire Détecteur Coupe (40 µm) d‘un rat non traité Source radioactive homogène GMP, Paris, Février 2004

Quantification Tissus Absorbance moyenne ± SD Foie 91.0 1.9 Moelle osseuse 91.2 2.2 Cerveau 91.6 1.9 Rate 92.0 1.6 Coeur 92.4 1.1 Rein 92.8 1.5 Glande salivaire 93.0 1.2 Vesicule séminale 93.0 1.2 Poumon 93.0 2.3 Surrénale 93.4 1.1 SANG 93.6 1.5 Muscle 94.0 1.6 Testicule/epididyme 94.0 1.5 Os minéral 38.4 0.9 Tissue adipeux 60.0 1.2 Globe oculaire 109.8 0.4 GMP, Paris, Février 2004

Quantification : “efficacité relative” DNC GMP, Paris, Février 2004

Quantification : épaisseur des coupes GMP, Paris, Février 2004

Quantification : conditions d’exposition GMP, Paris, Février 2004

Quantification : conclusions Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire ▼ Utilisation systématique indispensable des standards de calibration GMP, Paris, Février 2004

Quantification : DNC vs. LSC GMP, Paris, Février 2004

Quantification : QWBAL vs. DNC GMP, Paris, Février 2004

Interprétation des résultats vue d‘ensemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps distribution régionale dans les tissus et structures contrôle visuel de l‘absence de contamination archivage permettant une re-lecture/contre-expertise analyses complémentaires possibles GMP, Paris, Février 2004

Interprétation des résultats macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!) radioactivité totale, pas une structure chimique donnée pharmacocinétique! importance des conditions expérimentales purité radiochimique de la substance testée LOD, LOQ doses nominales, doses radioactives métabolites volatiles, 3H20 „ouvrir les yeux, voir large“ GMP, Paris, Février 2004

Principales applications contribution à la sélection de molécules (PD,Tox) contribution à la sélection de formulations (Galénique) études ADME (PK) safety assessment (ex: passage transplacentaire) (Tox) estimation de la radio-exposition (hADME) dossiers d‘enregistrement études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine, résidus, „mottled pattern“ etc) GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Exemples d’application GMP, Paris, Février 2004

Conclusions informations spécifiques, importantes nombreuses applications en recherche & développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc) difficultés techniques expertise nécessaire coût élevé des équipements  radioactivité totale, macroscopie, animal GMP, Paris, Février 2004

H.Harlemann, G.Gross, O.Kretz A.Wach, P.Schnider Remerciements H.Harlemann, G.Gross, O.Kretz A.Wach, P.Schnider GMP, Paris, Février 2004

Merci pour votre attention ! GMP, Paris, Février 2004