Etude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractérisation de la variabilité du gène prtS Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse PERRIN L'équipe Domestication en aquaculture continentale L'équipe Micropolluants & résidus dans la chaîne alimentaire L'équipe Protéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptides Je voudrais vous présenter mon travail qui est intitulé l’étude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez ST. thermophilus et nous nous sommes tout particulièrement focalisés sur la caractérisation de la variabilité du gène prtS. Wessam GALIA Ecole Doctorale RP2E 15 janvier 2009

Production de peptides bioactifs Le peptide bioactif d’origine alimentaire : ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels joue un rôle bénéfique chez le consommateur rôle anxiolytique ou anti hypertensif... Production de peptides bioactifs issus du lait La production d’un peptide bioactif d’origine alimentaire ce n’est pas pour répondre au besoin nutritionnelle mais pour jouer un rôle bénéfique chez le consommateur telle qu’un rôle anxiolytique ou anti hypertensif.. Il est connu que Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs Il y a 3 méthodes pour libérer ces peptides bioactifs : par protéolyse in vitro puis ajout à l’aliment par des protéases endogènes et ça se fait directement dans l’organisme Et en fin par l’utilisation des bactéries lactiques pendant la fabrication ou la transformation de l’aliment et ce cas qui m’intéresse car Je pense à utiliser

Production de peptides bioactifs issus du lait Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs : par protéolyse in vitro ajout à l’aliment directement dans l’organisme générés par des protéases endogènes 2 % des gènes humains codent pour des protéases ou des inhibiteurs de protéases pendant la fabrication / transformation de l’aliment (fermentation, affinage) générés par des bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ..) La production d’un peptide bioactif ce n’est pas pour faire un couverture nutritionnelle mais au delà de ça c’est pour jouer un rôle régulateur chez le consommateur telle que un rôle anxiolytique ou anti hypertensif..

Production de peptides bioactifs par voie microbienne Mieux comprendre le potentiel protéolytique d’une bactérie lactique : Streptococcus thermophilus Caractérisation du potentiel protéolytique Caractériser les différents acteurs du système Caractériser sa variabilité au sein de l’espèce St. thermophilus dans le but de sélectionner des souches capables de libérer des peptides bioactifs. Streptococcus thermophilus pour produire des peptides bioactifs directement en lait Pour cela il faut mieux caractériser les différents acteurs du système mais aussi bien Caractériser sa variabilité au sein de l’espèce St. thermophilus Dans le but de sélectionner une souche capable de libérer des peptides bioactifs directement en lait mais dans le cas qu’on n’arrive pas à trouver cette souche naturellement dans le potentille de faire des modifications génétiques de ce système

Streptococcus thermophilus Présentation de Streptococcus thermophilus Une des bactéries lactiques les plus utilisées dans l’industrie des ferments (du lait) Homofermentaire et se développe entre 37 et 42°C Appartient au genre Streptococcus Non pathogène Séquençage complet de 3 génomes a révélé : - l’absence des gènes de virulence - une faible variabilité de séquence Streptococcus thermophilus est une bactérie lactique qui appartient au groupe des bactéries Gram+ à bas GC. Il s’agit d’une des bactéries les plus utilisée en agro-alimentaire, elle est homofermentaire, c’est-à-dire qu’elle produit majoritairement de l’acide lactique à partir du lactose, elle est anaérobie-aérotolérante et se développe entre 37 et 42°C. Bien qu’appartenant à la famille des Streptococcaceae et tout particulièrement au genre Streptococcus qui renferme essentiellement des bactéries pathogènes,St. thermophilus n’est pas pathogène. Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004) 22:1554-1558

Variabilité phénotypique chez St. thermophilus Variabilité phénotypique affecte différents caractères tels que : - morphologie des colonies, - taille des chaînettes, - résistance à différents stress, - vitesse de croissance et d’acidification du lait En dépit de ce faible taux de divergence génétique, les souches présentent fréquemment des caractères différents tels que : -la morphologie coloniale, - la taille des chaînettes, -la résistance à différents stress, - la vitesse de croissance et d’acidification du lait. St. thermophilus comme les autres bactéries lactiques est auxotrophe pour la plupart des acides aminés. Or la concentration d’acides aminés libres et de petits peptides dans le lait n’est pas suffisante pour permettre à la bactérie de se développer et d’atteindre de fortes densités cellulaires. Elle est donc dépendante de son système protéolytique et une faible croissance en milieu lait peut donc provenir d’un système protéolytique déficient.

Système protéolytique de St. thermophilus Milieu extracellulaire Paroi bactérienne Ce système est constitué d’une protéase de paroi, de système de transport de peptides et d’acides aminés et de peptidase intracellulaires. La seule protéase de paroi isolée et caractériseé, à ce jour, chez St. thermophilus est la protéase PrtS. Cytoplasme Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 21:23-28

Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CW M C Dans tous les cas, on trouve 4 domaines qui sont bien conservés chez toutes les protéases membranaires chez les bactéries lactices si on commence de coté N terminale on a le prédomine qui est composé de la séquence signal et la proséquence qui seront clivée pendant l’excrétion et la maturation de la protéase, le domaine catalytique (qui est le plus conservé entre les protéinases des différentes bactéries lactiques), un domaine A, lui aussi relativement bien conservé mais de fonction inconnue et un domaine W hydrophile qui sert d’espaceur au niveau de la paroi. Le 5ème domaines est le domaine H qui est impliqué dans le positionnement des autres domaines hors de la cellule. Enfin, un domaine d’ancrage à la membrane cellulaire. Ce qu’il est intéressant à dire le domaine B, qui pourrait être impliqué dans la stabilisation de l’activité/spécificité de la CEP est absent de PrtS de Streptococcus thermophilus, prts se comporte de la même façon des autres protéases membranaires chez les streptocoques pathogènes. pour voir en détaille les caractéristiques de cette protéase je vous propose de voir les caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385. Pourquoi cette protéase car c’est la seule d’être purifier le jour que j’ai commencé mon travaille Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

(signal+proséquence) Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CW M C Prédomaine (signal+proséquence) PP PR Domaine catalytique A ? W W W Dans tous les cas, on trouve 4 domaines qui sont bien conservés chez toutes les protéases membranaires chez les bactéries lactices si on commence de coté N terminale on a le prédomine qui est composé de la séquence signal et la proséquence qui seront clivée pendant l’excrétion et la maturation de la protéase, le domaine catalytique (qui est le plus conservé entre les protéinases des différentes bactéries lactiques), un domaine A, lui aussi relativement bien conservé mais de fonction inconnue et un domaine W hydrophile qui sert d’espaceur au niveau de la paroi. Le 5ème domaines est le domaine H qui est impliqué dans le positionnement des autres domaines hors de la cellule. Enfin, un domaine d’ancrage à la membrane cellulaire. Ce qu’il est intéressant à dire le domaine B, qui pourrait être impliqué dans la stabilisation de l’activité/spécificité de la CEP est absent de PrtS de Streptococcus thermophilus, prts se comporte de la même façon des autres protéases membranaires chez les streptocoques pathogènes. pour voir en détaille les caractéristiques de cette protéase je vous propose de voir les caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385. Pourquoi cette protéase car c’est la seule d’être purifier le jour que j’ai commencé mon travaille W W Espaceur Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques Cell Wall Membrane Cytoplasme CW M C H Positionnement de A et B AN Ancrage Dans tous les cas, on trouve 4 domaines qui sont bien conservés chez toutes les protéases membranaires chez les bactéries lactices si on commence de coté N terminale on a le prédomine qui est composé de la séquence signal et la proséquence qui seront clivée pendant l’excrétion et la maturation de la protéase, le domaine catalytique (qui est le plus conservé entre les protéinases des différentes bactéries lactiques), un domaine A, lui aussi relativement bien conservé mais de fonction inconnue et un domaine W hydrophile qui sert d’espaceur au niveau de la paroi. Le 5ème domaines est le domaine H qui est impliqué dans le positionnement des autres domaines hors de la cellule. Enfin, un domaine d’ancrage à la membrane cellulaire. Ce qu’il est intéressant à dire le domaine B, qui pourrait être impliqué dans la stabilisation de l’activité/spécificité de la CEP est absent de PrtS de Streptococcus thermophilus, prts se comporte de la même façon des autres protéases membranaires chez les streptocoques pathogènes. pour voir en détaille les caractéristiques de cette protéase je vous propose de voir les caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385. Pourquoi cette protéase car c’est la seule d’être purifier le jour que j’ai commencé mon travaille Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406

Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines Capable d’hydrolyser les caséines S1 et  Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000) Il s’agit D’une protéase de 169 kDa et de 153 après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisine-like Capable d’hydrolyse les caséines S1 et  Retrouvée uniquement chez quelques souches Le Gène codant pour cette protéase est de 4755 pb, elle est exprimé en conditions de carence azotée La Régulation du gène prtS est inconnue Cette protéase de surface prtS a une activité protéolytique. Cette activité protéolytique de surface avaient été retrouvée uniquement chez quelques souches. Mais cette protéase n’avait pas encore été caractérisé

Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines Capable d’hydrolyser les caséines S1 et  Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000) Il s’agit D’une protéase de 169 kDa et de 153 après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisine-like Capable d’hydrolyse les caséines S1 et  Retrouvée uniquement chez quelques souches Le Gène codant pour cette protéase est de 4755 pb, elle est exprimé en conditions de carence azotée La Régulation du gène prtS est inconnue Cette protéase de surface prtS a une activité protéolytique. Cette activité protéolytique de surface avaient été retrouvée uniquement chez quelques souches. Mais cette protéase n’avait pas encore été caractérisé Activité protéolytique de surface retrouvée uniquement chez quelques souches Shahbal et al., AEM (1993)

Démarche expérimentale Evaluer la variabilité génétique d’une collection de souches de St. thermophilus Evaluer la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St. thermophilus Le système protéolytique de St. thermophilus est encore peu connu et nous avons, pour notre part , entrepris de caractériser la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St.thermophilus

Génotypage de souches de St. thermophilus Séquençage de la région Internal Transcribed Spacer 16S-23S Gène ARNr 16S Gène ARNr 23S ITS 16S-23S ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III ..........T... ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T... ITS-II ..........-... Consensus..........t... ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III ..........T... ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T... ITS-II ..........-... Nous disposions pour cela d’une collection de 28 souches de St. thermophilus issues de différentes origines et nous avons, dans un premier temps, choisi d’évaluer la variabilité génétique de ces souches. Pour cela, nous avons étudier la variabilité de l’ITS16S-23S qui est chronomètre moléculaire rapide, c’est-à-dire adapté à des temps évolutifs courts. Nous avons ainsi amplifier la séquence ITS16S-23S en utilisant des amorces complémentaires de séquences situées de part et d’autre et séquencer le produit obtenu. Toutes les séquences obtenues sont très similaires et contiennent un gène codant un ARN de transfert Alanine. La comparaison des séquences obtenues nous a permis d’identifier au sein de notre collection 3 types d’ITS différents. 17 souches possédent un ITS de type I, 10 de type II et les 3 dernières souches possèdent un ITS différent des 4 types décrits dans la littérature que nous avons nommé ITS de type V. Auncun ITS de type III et IV n’a été détecté. Mise en évidence d’un nouveau type ITS-V (Galia et al., 2009)

Génotypage de souches de St. thermophilus Mise en évidence d’une variabilité génétique au sein de la collection de souches de St. thermophilus En conclusion, la détermination de la séquence ITS16S-23S des souches de notre collection a révélé une variabilité génétique, nous plaçant donc dans une situation favorable pour étudier la variabilité du système protéolytique au sein de cette collection.

Variabilité du système protéolytique de surface Présence de la protéase de surface Forte croissance = fort pouvoir acidifiant Absence de la protéase de surface Faible croissance = faible pouvoir acidifiant Afin d’étudier la variabilité du système protéolytique de paroi au sein de notre collection, nous avons dans un premier temps évalué la croissance en milieu lait des différentes souches de la collection St. thermophilus est une bactérie homofermentaire qui lorsqu’elle se développe en milieu lait catabolise le lactose et excrète dans le milieu de l’acide lactique. Aussi, le suivi de l’acidification du milieu lait permet d’évaluer la croissance de cete bactérie dans ce milieu. Ainsi, les 28 souches de notre collection et la souche CNRZ1066 utilisé comme témoin ont été cultivé en milieu lait et l’acidification du milieu déterminée par mesure de l’acidité Dornic après, 2, 4 et 6 h de croissance. Comme vous pouvez le constater sur ce graphe, toutes les souches n’ont pas présenté le même pouvoir acidifiant. Trois groupes ont été distingués : un groupe de souches à fort pouvoir acidifiant, un groupe de souche ayant un pouvoir moyen d’acidification et enfin un groupe de souches à faible pouvoir acidifiant. Ces expériences nous ont permis de conclure que toutes les souches ne possédaient pas le même pouvoir acidifiant et donc peut-être le même potentiel protéolytique. Détermination de l’acidité Dornic (acide lactique produit) permet d’évaluer la croissance d’une souche en milieu lait

Variabilité du système protéolytique de surface après 6 h de croissance en lait (° Dornic) 12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4 ± 4,5°D 2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0 ± 2,4°D 16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8 ± 4,2°D Variabilité du système protéolytique de surface ?

Variabilité du système protéolytique de surface Recherche du gène prtS 800 pb Souches à fort pouvoir acidifiant 12/12 souches posséderaient le gène prtS Souches à faible pouvoir acidifiant 2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS Comme cela a été dit précédemment la seul protéase de paroi connue chez St. thermophilus est la protéase PrtS. Nous avons ainsi recherché son gène dans toutes les souches de notre collection en utilisant des amorces permettant d’amplifier une séquence interne au gène. Deux remarques intéressantes à dire : La plupart de nos souches possèdent le gène prts ce qui est en contradiction avec ce qu’il a été publié car le jour où on a commencé ce travail il était connu dans la littérature que la plupart des souches de s. thermophilus ne possédaient pas la protéase prts Deuxième remarque pourquoi les souches à moyen pouvoir acidifiant qui possèdent le gène prts ne sont pas à fort pouvoir acidifiant Souches à moyen pouvoir acidifiant 11/16 souches posséderaient le gène prtS 5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS

Variabilité du système protéolytique de surface Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie CNRZ1066 LMD9 PB18o PrtS Afin de comprendre pourquoi certaines souches possédant le gène prtS avaient un mauvais pouvoir acidifiant, nous avons recherché la présence de protéase(s) caséinolytique(s) de surface dans chaque souche. Cette recherche a été réalisée par zymographie à partir d’ et d’extraits protéiques. Dans ces expériences, 2 témoins ont été utilisés : 1 témoin négatif (= souche CNRZ1066) qui ne comporte pas le gène prtS et 1 témoin positif (souche CNRZ385) qui possède ce gène. Comme vous pouvez le contaster, dans les fractions de la souche CNRZ385 et non dans celles de la souche CNRZ 1066, deux ou 3 plages d’hydrolyse sont détectées et de masse moléculaire compatibles avec la masse connue de la protéine PrtS. Nous pouvons émettre l’hypothèse que ces plages d’hydrolyses correspondent à la protéase PrtS.

Variabilité du système protéolytique de surface Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie pour toutes les souches PrtS Pouvoir acidifiant Nombre de souches Faible 2 Moyen 5 8 3 Fort 12 Présence du gène prtS - + Activité protéolytique +++ Afin de comprendre pourquoi certaines souches possédant le gène prtS avaient un mauvais pouvoir acidifiant, nous avons recherché la présence de protéase(s) caséinolytique(s) de surface dans chaque souche. Cette recherche a été réalisée par zymographie à partir d’ et d’extraits protéiques. Dans ces expériences, 2 témoins ont été utilisés : 1 témoin négatif (= souche CNRZ1066) qui ne comporte pas le gène prtS et 1 témoin positif (souche CNRZ385) qui possède ce gène. Comme vous pouvez le contaster, dans les fractions de la souche CNRZ385 et non dans celles de la souche CNRZ 1066, deux ou 3 plages d’hydrolyse sont détectées et de masse moléculaire compatibles avec la masse connue de la protéine PrtS. Nous pouvons émettre l’hypothèse que ces plages d’hydrolyses correspondent à la protéase PrtS.

Variabilité de l’activité protéolytique de surface Pourquoi ? Gène prtS muté Gène prtS non exprimé Séquençage du gène prtS chez : 4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS-) 3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS+) Comparaison de séquences : 100% identiques entre elles et avec la souche LMD-9 95% identiques avec la souche CNRZ385 La comparaison de séquences a montré une identité à 100 % entre elle mais aussi avec celle de la souche LMD9 pour la quelle son génome a été séquencé entièrement : pour cette première partie de résultat deux conclusion intéressant à dire 1- Les différences observées au niveau du pouvoir acidifiant ne sont pas expliquées par des gènes prtS différents D’ailleurs le gène prts semble t il fonctionnelle chez les deux groupes de souches et nous avons met comme hypothèse qu'il ya une différence de régulation de gène prts entre les deux groupes. 2- l’allèle de LMD9 est le plus répondu au sein de notre collection Deuxième partie de résultat une identité au niveau d’acide aminée de 95% a été trouvée avec la protéase publié chez cnrz385 la différence se concentre à 3 niveau

Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : PB18o ou LMD9 720VQNGLITLAPRLLAEIPGGKVTVQ743 CNRZ 385 688AQKRIDHLGSTSISRDSWRKVTVK711 fonction inconnue PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946 CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914 Région fixation du substrat SS PP PR A H W AN PB18o ou LMD9 1 36 177 492 1110 1477 1583 1618 CNRZ 385 1 36 145 460 1077 1444 1550 1585 PB18O OU LMD9 60SESPVAEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETLGSESPVVEELVDTSVEATPTDVTTTDNVEETLGSE126 CNRZ385 60--------------------------------SESPVVEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETPGSE94 Afin de tester ces hypothèses, nous avons entrepris le séquençage du gène prtS dans les souches 1, 3 et 7. La souche 1 a été choisie comme témoin des souches possédant le gène prtS mais n’ayant pas d’acivité caséinolytique. Les souches 3 et 7 comme témoins des souches ayant prtS et une activité caséinolytique.détectable. De plus, nous avons choisi de séquencer le gène prtS dans 2 souches le possédant et exprimant une activité caséinolytique afin de déterminer s’il existait polymorphisme de séquence en tre ces 2 souches. A l’aide de plusisieurs couples d’amorces le gène prtS a été amplifié chez ces trois souches et les amplicons obtenus séquencés. Dans les 3 cas une séquence identique a été obtenue. Ces séquences présentent par alilleurs 96.1% d’identité au niveau nucléotidique avec la séquence du gène prtS de la souche CNRZ385. Les différences sont essentiellement concentrées dans les 600 premeirs nucléotides. A ce niveau, une duplication de 96 pb est observée. PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : Région fixation du substrat PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946 CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914 Afin de tester ces hypothèses, nous avons entrepris le séquençage du gène prtS dans les souches 1, 3 et 7. La souche 1 a été choisie comme témoin des souches possédant le gène prtS mais n’ayant pas d’acivité caséinolytique. Les souches 3 et 7 comme témoins des souches ayant prtS et une activité caséinolytique.détectable. De plus, nous avons choisi de séquencer le gène prtS dans 2 souches le possédant et exprimant une activité caséinolytique afin de déterminer s’il existait polymorphisme de séquence en tre ces 2 souches. A l’aide de plusisieurs couples d’amorces le gène prtS a été amplifié chez ces trois souches et les amplicons obtenus séquencés. Dans les 3 cas une séquence identique a été obtenue. Ces séquences présentent par alilleurs 96.1% d’identité au niveau nucléotidique avec la séquence du gène prtS de la souche CNRZ385. Les différences sont essentiellement concentrées dans les 600 premeirs nucléotides. A ce niveau, une duplication de 96 pb est observée. PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

Activité caséinolytique Conclusion Variabilité du système protéolytique de surface - Variabilité en terme de présence / absence du gène prtS - 2 allèles prts différents ont été mis en évidence chez S. thermophilus Variabilité affecte la régulation du gène Pouvoir acidifiant Gène prtS Activité caséinolytique Fortes 12/12 12 Moyennes 11/16 3/16 Faibles 0/2 Une conclusion à dire Au sein de chaque groupe les souches sont très apparenté entre elle

Perspectives : Perspectives : - Etude de la régulation du gène prtS entre - les souches qui ont le gène et qui l’expriment fortement - et les souches qui ont le gène et qui l’expriment peu ou pas.