INSTITUT NATIONAL DE FORMATION EN SCIENCES DE LA SANTÉ TECHNIQUES DE COLORATION SPÉCIALES GROUPE 1

INTRODUCTION Les colorations spéciales sont réalisées pour préciser des structures ou substances suspectées par le pathologiste lors de son analyse initiale sur les coupes de technique standard. Les techniques histochimiques sont basées sur des réactions biochimiques qui permettent de mettre en évidence in situ (= dans les tissus), différents constituants(lipides, glucides, protéines, acides nucléiques, métaux,etc)

TECHNIQUE DE DEPARAFFINAGE Retirer la ou les lame(s) destinée(s) à la coloration dans l’étuve Plonger la ou les lame (s) dans 3 bains de xylène soit 3 mn pour chaque bain Faire une réhydratation avec 4 bains d’alcool de concentration décroissante : 1er bain Alcool 100°……….3 minutes 2ème bain Alcool 100°……….3 minutes 3ème bain Alcool 95°…….…...3 minutes 4ème bain Alcool 70 °….…......3 minutes 4. Faire un rinçage dans l’eau pendant 5 minutes

TRICHROME DE MASSON APPLICATION Cette coloration met en évidence les fibres de collagènes. Cette méthode est très populaire et utile dans l’étude de la pathologie du cœur (infarctus), foie (cirrhose )rein (fibrose glomérulaire)

TRICHROME DE MASSON RÉACTIFS Mélange fuchsine ponceau 2R ( Fuchsine acide + Ponceau de xylidine ) Eau acétique à 1 % Bleu d’aniline Vert Lumière SF Hémalun de Mayer Acide phosphomolybdique

TRICHROME DE MASSON TECHNIQUE (2) Deparaffiner les lames et les réhydrater Coloration prolongée des noyaux dans hémalun de Mayer 10 mn ou plus Rincer à l’eau jusqu’à bleuissement des coupes Colorer les cytoplasmes par le mélange fuchsine-ponceau pendant 5 mn Rincer à l’eau acétique à 1%

TRICHROME DE MASSON TECHNIQUE (3 6. Différencier dans une solution aqueuse à 1% d’acide phosphomolybdique environ 5 mn 7. Sans rincer, colorer le collagène par bleu d’aniline pendant 1min 8. Rincer à l’eau acétique à 1 % passage 9. Plonger directement en alcool à 100° 10. Xylène 11. Montage

TRICHROME DE MASSON RÉSULTATS Noyaux………………… bleu-noirs ou bruns Cytoplasmes…………… Rouges Collagène……………….. Bleu ou Vert

TRICHROME DE MASSON

PERIODIC ACID DE SCHIFF (PAS) APPLICATION La coloration PAS (pour Periodic Acid Shiff) met en évidence les mucines (épith. à bordures en brosse), les membranes basales, le glycogène ainsi que les filaments et spores mycéliens.

PERIODIC ACID DE SCHIFF (PAS) RÉACTIFS Acide périodique à 0,5% Réactif de Schiff Acide chlorhydrique (HCl) 1N Hemalun de Mayer

PERIODIC ACID DE SCHIFF (PAS) TECHNIQUE (1) Déparaffinage, alcools Rincer les lames avec de l’eau courante Acide périodique en solution aqueuse à 0,5% pendant 10min Lavage à l’eau courante Rincer à l’eau distillée

PERIODIC ACID DE SCHIFF (PAS) TECHNIQUE (2) 6. Réactifs de Schiff pendant 15 à 30min 7. Lavage à l’eau courante au moins 15min 8. Hémalun de Mayer 2min 9. Rincer à l’eau courante 10. 2 bains successifs d’alcool absolu 11. 2 bains successifs de xylène 12. Montage

PERIODIC ACID DE SCHIFF (PAS) RÉSULTAT Mucopolysaccharides acides…………………………. Rouge violacé REMARQUE Le PAS est couramment associé à la diastase (PASdiastase) qui permet une coloration rosée des mucines intra ou extracellulaires . Elle permet d’orienter le diagnostic vers une origine glandulaire(adénocarcinome). Elle est demandée dans le diagnosticde pathologies du foie et rein.

Periodic acid of schiff ( P.A.S)

BLEU ALCIAN REACTIFS Bleu Alcian 8GX à 1% à pH 2,5 APPLICATION Cette coloration est souvent demandée en complément au PAS, PAS-diastase car il révèle les mucines acides. REACTIFS Bleu Alcian 8GX à 1% à pH 2,5 Acide acétique glacial du commerce à 3% Acide acétique à 3% en solution aqueuse 100ml

BLEU ALCIAN TECHNIQUE (1) Déparaffinage, alcools Eau courante Coloration dans une solution de Bleu alcian 8GX pendant 30 à 45min Bien rincer à l’eau courante…10min

BLEU ALCIAN TECHNIQUE (2) 5. Contre coloration au rouge nucléaire à 0,2% pendant 3 à 4min 6. Laver à l’eau courante 7. Alcool absolu 2 bains 8. Xylène 2 bains 9. Montage

BLEU ALCIAN RÉSULTAT Les mucopolysaccharides acides.……………… Bleu turquoise Noyau………………………………………………. rouge Fond………………………………………………… rose pâle

Bleu Alcian

ROUGE CONGO APPLICATION Cette coloration marque en rouge les dépôts d'amylose REACTIFS Solution d’alcool alcalin saturé de NaCl Solution de rouge congo alcalin saturé de Chlorure de sodium Alcool Ethylique à 80° selon la table de Gay Lussac Solution aqueuse à 1% de soude Hemalun de Mayer

ROUGE CONGO TECHNIQUE (1) Les lames déparaffinées sont amenées à l’eau Hémalun de Mayer………………….10min Rincer à l’eau courante jusqu’à bleuissement des coupes Transférer les lames dans la solution d’alcool alcalin saturé de NaCl 20min

ROUGE CONGO TECHNIQUE (2) 5. Sans rincer transférer les lames dans la solution rouge Congo alcalin saturé de NaCl 20min 6. Passer dans l’alcool 100° 7. Xylène 8. Montage

ROUGE CONGO RÉSULTAT Substance amyloïde…………… Rose Noyaux……………………………Bleu Fond……………………………….jaune

Rouge Congo

OIL RED O SOUDAN IV REACTIFS APPLICATION Cette coloration est utilisée pour la détection des lipides REACTIFS Oil Red O ou Soudan IV Alcool isopropylique Eau distillée

OIL RED O SOUDAN IV TECHNIQUE (1) 1. Cette détection se fait habituellement sur frottis séchés à l’air coupes à congélation à partir de pièces fraîches ou fixées dans le formol 2. Coupes à congélation de matériel frais ou fixé au formol 3. Rinçage à l’eau si coupes fixées au formol

OIL RED O SOUDAN IV TECHNIQUE (2) 4. La solution d’Oil Red O* est mise directement sur lame 5min 5. Rinçage à l’eau……………...qlq sec 6. Hémalun de Mayer (nucléaire) 1min 7. Rinçage à l’eau 8. Montage dans un milieu hydrophile (aquamount**) 9. Laisser sécher

OIL RED O SOUDAN IV RÉSULTAT Lipides en phase liquide (triglycérides, acide gras, cholestérides)………………………Rouge vif Lames et fibres élastiques……….. violet foncé

OIL RED O SOUDAN IV

MALLORY APPLICATION REACTIFS Permanganate de potassium à 0,25% Produit pour la préparation d'échantillons cyto-histologiques à examiner en microscopie optique. Méthode de référence pour la visualisation du tissu conjonctif sur des coupes histologiques ; particulièrement indiquée pour la mise en évidence de collagène, réticule, cartilage, os, amyloïde. REACTIFS Permanganate de potassium à 0,25% Acide oxalique à 1% Hématoxyline de Mallory

MALLORY TECHNIQUE (1) Déparaffiner Hydrater Permanganate de potassium à 0,25%* (en solution fraiche) 5min Rincer à l’eau courante Blanchir dans l’acide oxalique à 1% 1 à 5min

MALLORY TECHNIQUE (2) 6. Le blanchiment de la coupe doit être complet 7. Rincer à l’eau courante 8. Hématoxyline de Mallory 12 à 24h 9. Laver à l’eau distillée 10. Déshydrater rapidement en alcool 11. Toluène 12. Montage

MALLORY RÉSULTAT Chromatine……………… Bleu noir Cytoplasme…………….. Bleu violacé Collagène……………….. Rose pourpre Mucus……………………. Orange

Mallory

GOMORI GROCOTT APPLICATION Cette coloration met en évidence les micro-organismes soit les levures ou champignons (C. Albicans) et parasites. Les glucides de la paroi des champignons sont transformés en aldéhydes par oxydation. REACTIFS Acide chromique en solution à 10% Solution aqueuse de bisulfite de sodium (1%) Solution d’argent méthènamine Vert Lumère SF

GOMORI GROCOTT TECHNIQUE (1) Au cours de cette technique il est impératif d’utiliser de la vaisselle propre (rincée à l’eau bidistillée) et de ne jamais se servir de matériel métallique (pince, support de lames…) 2. Travailler avec un témoin positif

GOMORI GROCOTT TECHNIQUE (2) 3. Déparaffinage 4. Eau distillée 5. Oxyder dans la solution d’acide chromique* (trioxyde de chrome en solution aqueuse) à 10% 10min 6. Laver à l’eau courante……10min 7. Décolorer dans une solution aqueuse de bisulfite de sodium (1%)**(Le blanchissement de la coupe doit être complet)

GOMORI GROCOTT TECHNIQUE (3) 8. Solution fraîche d’argent méthènamineà 56° récipient couvert environ 60min 9. Contrôler en cours de réaction que le réactif reste incolore 10. Arrêter la réaction lorsque les coupes sont brunâtres (suivre sur le témoin) 11. Au sortir du bain d’argent méthènamine Rincer soigneusement à l’eau bidistillée

GOMORI GROCOTT RÉSULTAT Champignons et Pneumocystis Carinii colorés en noir, sur fond vert

GOMORI GROCOTT

PICRO SIRUS APPLICATION Elle est utilisée pour la coloration du collagène de type I et de la réticuline (collagène de type III) REACTIFS Acide picrique-solution aqueuse à saturation

PICRO SIRUS TECHNIQUE (1) Déparaffinage: Alcool absolu Eau Picro-sirius 30mn Eau courante 2 bains alcool à 100° passage 5. Xylène 6. Montage

PICRO SIRUS RÉSULTAT Coloration du collagène de type I et de la réticuline de type III • Collagène coloré spécifiquement rouge

Picro-Sirius

CARMIN DE BEST APPLICATION Cette coloration est utilisée pour connaitre la charge réelle en glycogène des cellules. REACTIFS ( 1) Solution A: carmin de Best • Carmin………………………….2g • Carbonate de potassium…………………1g • Chlorure de potassium…………………….5g • Eau distillée……………………60ml

CARMIN DE BEST REACTIFS (2) Solution B •Ammoniaque ………………………..30ml •Alcool méthylique….………………30ml Solution A + B de travail* • Solution A……………………..1vol • Solution B………………………2vol Solution C • Solution méthylique ……………4ml • Solution éthylique……………..…..8ml • Eau distillée…………………………...10ml

CARMIN DE BEST TECHNIQUE (1) Déparaffinage, alcools Eau courante Colorer rapidement à l’Hémalun de Mayer 2min Rincer à l’eau courante

CARMIN DE BEST TECHNIQUE (2) 5. Techniquer les lames de façon verticale, non à plat, dans un tube Borel 6. Colorer dans une solution A + B de travail pendant 5min 7. Sans laver, sans différencier, rincer la coupe rapidement dans la solution C jusqu’à l’arrêt de l’extraction du rouge par la solution 8. Rincer rapidement la coupe à l’alcool à 80° 9. Alcools absolus 10. Xylène 11. Montage

CARMIN DE BEST RÉSULTAT Glycogène……………………….rouge carminé Noyau……………………………..bleu Fibrine et mucine…………….rouge

Carmin de Best

Perls ou Bleu de prusse APPLICATION La coloration perls est utilisée pour la coloration des ions ferrique, REACTIFS Ferrocyanure de potassium trihydratée à 2% Acide chlorhydrique à 2% dans de l’alcool à 70°

Perls ou Bleu de prusse TECHNIQUE (1) Déparaffinage, alcool 100°, 90° Eau courante Recouvrir la lame avec un mélange à parties égales de ferrocyanure de potassium tri hydratée à 2% (solution préparée extemporanément) et d’acide chlorhydrique à 2% dans de l’alcool à 70°

Perls ou Bleu de prusse TECHNIQUE (2) 4. Recouvrir la lame du mélange 20-30min 5. Rinçage à l’eau courante 6. Contre coloration au rouge nucléaire à 0,2% pendant 5min 7. Déshydratation 8. Alcools 9. Xylène 10. Montage

Perls ou Bleu de prusse RÉSULTAT Cette coloration met en évidence tous les ions ferriques en milieu acide • Ferrique……………… Bleu foncé •Noyau………………… Rouge

GIEMSA LENT APPLICATION La coloration Giemsa permet de mettre en évidence la présence de microorganismes dans tous types de tissus. Elle peut notamment être utilisée pour détecter la présence de Helicobacter pylori dans le diagnostic d'ulcères gastriques ou de gastrites chroniques

GIEMSA LENT REACTIFS Solution de Giemsa lent pour histologie Eau bi distillée tamponnée à pH7 ou tampon phosphate à pH7 Hemalun de Mayer

GIEMSA LENT TECHNIQUE (1) Déparaffinage et réhydrater les lames en eau distillée Colorer dans la solution de Giemsa lent fraichement diluée pendant 60min Rincer à l’eau distillée Différencier rapidement dans l’eau acétifiée, la coupe devient rose pendant 5 à 10sec Transférer rapidement en alcool à 95°, la coupe devient bleue Rinçage avec alcool isopropylique 2 bains de 1min chacun

GIEMSA LENT TECHNIQUE (2) 8. Rinçage avec alcool isopropylique 2 bains de 1min chacun 9. Alcool isopropylique 10. Xylène 11. Montage

GIEMSA LENT RÉSULTAT Helicobacter pylori ………………………Bleu Chromatine, Nucléole…………………………….camaïeu de bleus Plasmocytes: cytoplasme………………………. Bleu intense Granulations éosinophiles……………………….Rose Granulations des mastocytes…………………. violet intense

Giemsa

Ziehl-Neelsen APPLICATION Cette coloration est utilisée pour la recherche de Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants . Elle est requise en cas de suspicion clinique ou histologique de tuberculose, d’infections par mycobactéries atypiques chez des sujets atteints de SIDA (bacilles incurvés et perlés)

Ziehl-Neelsen REACTIFS Fuchsine phéniquée de Ziehl Alcool acide à 1% Bleu de Méthylène à 0,15%

Ziehl-Neelsen TECHNIQUE (1) Déparaffinage dans 3 bains d’une solution comportant un volume d’huile de paraffine pour 1 volume de Xylène……………….10min chaque Essuyer l’excès d’huile et tamponner très délicatement la coupe avec du papier filtre (papier buvard fin). Laver à l’eau courante…………………………………………passage Rincer dans l’eau distillée Essuyer pour retirer l’excès d’eau Colorer par Fuchsine phéniquée* de Ziehl…………………30min sur la paillasse sans chauffer

Ziehl-Neelsen TECHNIQUE (2) 7. Essuyer et sécher au papier filtre 8. Décolorer solution d’alcool-acide à 1%** jusqu’à l’obtention d’une teinte rose légèrement soutenue 9. Rinçage à l’eau courante pour stopper la différenciation…….Passage 10. Contre coloration du fond en recouvrant la lame par une solution de Bleu de Méthylène*** jusqu’à ce que le fond soit bleu (5 ou 6 trempages)…………………….qq sec 11. Rinçage à l’eau courante

Ziehl-Neelsen TECHNIQUE (3) 12. Alcool absolu (3 bains) 13. Xylène 14. Eukitt RÉSULTAT Bacilles acido-alcoolo-résistants……………..rouge Gl. Rouges……………………………………jaune Fond……………………………………....Bleu pâle

Coloration de Ziehl

APPLICATION SPÉCIFICITÉ BLEU ALCIAN ROUGE CONGO OIEL RED O PICO SIRUS COLORATION APPLICATION SPÉCIFICITÉ TRICHROME DE MASSON Tous Collagène (bleu) ; cytoplasme (rose-rouge), noyaux (noir) BLEU ALCIAN Mucoplysaccharides et mucines acides Acide Hyaluronique, mucus (bleu) ROUGE CONGO Recherche d’amyloïde Amyloïde (rose) OIEL RED O Tissu Adipeux, inclusions lipidiques Lipides (rouge ) GOMORI GROCOTT Champignons Champignons (noir) PICO SIRUS Collagène (rouge). En lumière polarisée (biréfringence) : distinction entre fibres (vert) et faisceaux (jaune-orange)

APPLICATION SPÉCIFICITÉ COLORATION APPLICATION SPÉCIFICITÉ ZIEHL-NEELSEN Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants Bacilles acido-alcoolo-résistant (rouge) PERLS Ions ferrique Ferrique ( bleu foncé) GIEMSA LENT Microorganismes Helicobacter Heilmanni (Bleu ) CARMIN DE BEST glycogène Glycogène (rouge carminé) P.A.S les mucines , les membranes basales, le glycogène , les filaments et spores mycéliens. Mucopolysaccharides acides (Rouge violacé )