Les facteurs de virulence des bactéries à tropisme intestinal JM SCHEFTEL Vendredi 4 mars 2011 Master Physio-Pathologie Cellulaire et Moléculaire

Les bactéries à tropisme intestinal engendrent différents types de syndromes gastro-intestinaux infectieux Gastro-entérite aiguë Diarrhées hydriques: cholériformes Diarrhées dysentériques: dysentériformes Diarrhées hémorragiques, ulcéro-hémorragiques

Bactéries à tropisme intestinal, responsables de syndromes digestifs: exemples Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Yersinia enterocoltica Escherichia coli (pathovars) Vibrio cholerae Campylobacter jejuni Aeromonas hydophila Clostridium difficile Staphylococcus aureus

Les différents types de diarrhées infectieuses mettent en jeu des mécanismes physio-pathologiques spécifiques basés sur l’ implication de facteurs de virulence selon des stratégies de mieux en mieux connues. Facteurs de virulence Facteurs d’adhésion, facteurs de colonisation Facteurs d’invasion Production d’entérotoxines cytotoniques ou cytotoxiques

Escherichia coli : exemple type Entérobactérie commensale habituelle du côlon, prédominante au sein de la flore aérobie-anaérobie facultative de l’intestin Mais certaines souches (pathovars ou pathotypes) sont de véritables pathogènes intestinaux en provoquant différents types de syndromes gastro-intestinaux.

Les différents pathovars d’ E.coli From Bacterial Pathogenesis 1994

Modèle de virulence pour le pouvoir d’adhésion Les souches EPEC Modèle de virulence pour le pouvoir d’adhésion Les EPEC : 1ères souches d’E.coli identifiées comme agent de diarrhées responsables de troubles intestinaux graves chez les jeunes enfants enfants de moins d’un an. Diarrhée néo-natale (important taux de décès dans les pays en voie de développement ) Virulence: Présence de facteurs d’adhésion Présence de facteurs d’attachement-effacement Absence de facteurs entérotoxiques

les formes d’attachement de la bactérie à l’entérocyte

lumière intestinale bactérie piédestal

Travaux de Ilan Rosenshine Ann de l’Institut Pasteur, actualités (1997) 8,2,157-161

Liaison initiale Liaison initiale : due à des pili qui forment des faisceaux BFP: bundle- forming pili fimbriae de type IV BFP provoque agrégation des EPEC et la formation de micro- colonies à la surface de la cellule hôte. Les bactéries attachées par BFP se trouvent à une distance de 100 nm à 300 nm de la membrane de la cellule hôte. Ce contact avec l’entérocyte déclenche chez EPEC l’expression de l’ îlot de pathogénicité (locus d’effacement des entérocytes) ex Hp 90 TIR

Liaison intime Liaison intime : produite par une protéine de la membrane externe, l’intimine. La distance entre la membrane externe et la cellule hôte est de 10 nm L’ intimine induit la formation d’une protéine par le système TSSS (type III secretion system) qui est insérée dans la membrane :Translocated intimin receptor (TIR) (ex Hp 90) Esps: EPEC secreted proteins EspA, EspB, EspD engagées dans le processus d’attachement-effacement ex Hp90 TIR

La signalisation intracellulaire Phosphorylation de la tyrosine de TIR Activation de la phospholipase C Génération d’un flux Inositol P IP3 provoque un flux de Ca2+ Activation de LCM kinase: phosphory lation de LCM. Polymérisation de l’actine et phosphorylation de la myosine formation d’un piédestal ex Hp 90 TIR

Polymérisation de l’actine Piédestal à l’origine de la formation des lésions A/E de la bordure en brosse. Les gènes nécessaires à ces processus sont regroupés dans le locus d’effacement des entérocytes (LEE) C’est un îlot de pathogénicité de 35 kb contenant les gènes d’un système secréteur de type III et de protéines effectrices transportées dans la cellule

Piédestal et EPEC

Travaux de J Cleary et al Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adhesion to intestinal Epithelial cells: role of bundle-forming pili (BFP), EspA filaments and intimin Microbiology 150 ,2004, 527-538

Protocoles expérimentaux (E.coli) Travaux de Cleary et coll (2004) Souches Génotype Phénotype bfpA espA eae cellules intestinales Caco-2 adhésion E2348/69 + + + 100 UMD 880 + - - 110 UMD 886 - + - 8 UMD 883 - - + 0 UMD 888 - - - 0

La souche sauvage E.coli 2348/69 adhère rapidement (< 10 min) à la bordure en brosse des cellules Caco-2 et forme des micro-colonies et des lésions typiques A/E. La souche double mutante UMD880 (bfpA+, espA-,eae-) adhère aussi rapidement La souche UMD886 (bfpA-, espA+,eae-) adhère plus tardivement (> 1h) et moins efficacement. La microscopie confocale indique que l’adhésion est médiée par BFP et EspA La souche UMD883 (bfpA-, espA-,eae+) , incapable d’effectuer la translocation de TIR , n’adhère pas. La souche UMD 888 triple mutante (bfpA-, espA-,eae-) est incapable d’adhérer

Microscope confocal à balayage laser

Principe du microscope confocal

Cellules Caco-2 normales Microscopie confocale: a:vue horizontale et b: vue verticale coloration de l’actine (vert: fluorescéine) c:Microscopie électronique à balayage

Cellules Caco-2 infectées par la souche sauvage E.coli E2348/69 a: 10 min : bactéries (rouges) adhérentes à la bordure en brosse (BB:vert) b: bactéries expriment BFP (rouge), EspA (vert), intimine (vert) c: BFP (vert) induit l’attachement initial à BB(rouge) et agrégation bactérie- bactérie (bleue) d et e: après 3 h : micro-colonies (bactéries liées par BFP) f: après 6 h (A/E lésions) h : SEM: A/E lésions (scanning electron micrograph)

Microscopie confocale : a , b, c, e, f SEM : d Souche E.coli UMD 88O bfpA +, espA-, eae- (a) : adhésion en 10 min (b et c) : fibrilles de BFP adhérents à BB SEM: fibrilles BFP adhérents aux microvillosités e et f : micro-colonies

Microscopie confocale: : cellules Caco-2 infectées par souche E.coli UMD 886(bfpA - espA+ eae -) 3h: quelques bactéries (rouge) adhérentes à la bordure en brosse (vert) (b): adhésion x10 après lavage modéré (c et d) visualisation des filaments EspA (vert) impliqués dans l’adhésion.

Microscopie confocale: a, b et c Co-infection: A: souche E.coli UMD 883 bfpA-, espA-, eae+ et B : E.coli bfpA+, espA+, eae- Seule souche A colorée : adhésion 3h (accrétion d’actine en vert et bactérie en rouge)

Pouvoir pathogène des EPEC Capacité d’absorption réduite due à la perte des micro-villosités Stimulation de la sécrétion de chlorures Perméabilité accrue de l’épithélium

Modèle de pouvoir invasif Diarrhées dysentériques dues à Shigella spp Facteurs de virulence: Facteurs invasifs Facteurs de dissémination intracellulaire Associé à production d’entérotoxines

Les shigelles pénètrent par les cellules M des plaques de Peyer Facteurs de virulence: codés par le plasmide de virulence de 220 kb sécrétés par l’intermédiaire du système de sécrétion de type III Ipa A, Ipa B, Ipa C, Ipa D : invasines

Description du processus d’invasion Fait intervenir des changements au niveau des des composants du cytosquelette de la cellule au niveau de l’actine conduisant à la formation d’extensions cellulaires et de rides Extrusion de la membrane soutenue par des filaments d’actine entourant la bactérie La bactérie est captée, enveloppée, engloutie en 5-10 min. Il y a activation de GTP ases de type Rho, de la vinculine, recrutement de protéines d’adhésion (ezrine, paxilline,) pour former un complexe d’adhésion focalisé (rôle de Ipa D). Mécanisme de macropynocytose. La bactérie est internalisée dans une vacuole, le phagosome. Lyse de la membrane du phagosome (rôle de Ipa B et Ipa C)

Description du processus de dissémination Dissémination de la bactérie à l’aide des filaments d’actine la propulsant dans le cytosol vers les cellules adjacentes. Rôles de IcsA, de cadhérine IcsA induit la polymérisation de filaments d’actine, à l’un des pôles de la bactérie.Ceci propulse la bactérie à l’intérieur du cytoplasme dans la direction opposée à cette queue en croissance La queue reste stationnaire dans le cytoplasme. C’est le dépôt continu d’actine sur cette queue qui fait se déplacer la bactérie. La bactérie « mobile »  peut pénétrer dans une cellule adjacente en formant une poche dans la membrane.

Accès de Shigella à la membrane baso-latérale des entérocytes du côlon? la localisation de Shigella sur la muqueuse apicale stimule la migration des PNN ou macrophages sur la face basale. La rupture des jonctions intercellulaires qui s’ensuit permet aux bactéries de traverser cet espace et d’accéder à la face baso-latérale. Endocytose par la face BL augmentant le potentiel invasif de shigella

Facteur de virulence: entérotoxine cytotoxique Type de la diarrhée dysentérique Toxines de Shiga, toxines shiga-like (EIEC) Vérotoxines (EHEC): VT1 , shiga-like toxin (SLT 1) VT2 : 60% identité avec VT1 (SLT 2) Toxine de Shiga: protéine multimérique de 70 kDa composée d’une sous-unité (su) A catalytique de 32 kDa et de 5 su B de 7,7 kDa Les su B se fixent sur un récepteur de nature glycolipidique : globotriaosyl céramide (Gb3) sous unité A est internalisée par endocytose Un phagolysosome se forme dans lequel les enzymes lysosomiaux clivent A en A1 La su A1 inhibe la synthèse protéique en inactivant la su 60 S du ribosome par arrêt de la fixation TRNA-AA induisant l’arrêt de l’élongation des protéines d’où un effet cytoxique

Facteur de virulence: entérotoxine cytotonique Type de la diarrhée hydrique Toxine thermolabile d’E.coli ou Toxine cholérique de Vibrio cholerae Protéines multimériques de 84 kDa 1 su A de 28 kDa catalytique constituée de 2 su A1 et A2 liées par un pont di-S 5 su B de 11,5 kDa de fixation Mode d’action: su B se fixent à un ganglioside (GM1) présent sur la membrane des entérocytes Changement conformationnel de la toxine - création d’un canal hydrophile

Conclusions Les bactéries pathogènes à tropisme intestinal développent des stratégies basées sur des capacités d’adhésion, de colonisation d’invasion d’élaboration de facteurs entérotoxiques Ces facteurs de virulence sont à l’origine des manifestations digestives observées dans chaque type de pathologie.